Ensaio de atividade do receptor-repórter de estrogênio para rastrear a atividade estrogênica do fitoestrogênio

Resumo

Fonte: Fender, E. et al., Triagem de fitoestrogênios usando um ensaio de repórter β de receptor de estrogênio baseado em células. J. Vis. Exp. (2021).

Este vídeo descreve um ensaio repórter baseado em células para determinar a atividade estrogênica de compostos derivados de plantas. Um composto com atividade semelhante ao estrogênio imita sua ligação aos receptores de estrogênio e impulsiona a transcrição do gene da enzima repórter a jusante. A enzima repórter gera bioluminescência em uma reação, indicando a atividade estrogênica do composto.

Protocolo

1. Ensaio de transfecção de β receptor de estrogênio humano

NOTA: A técnica asséptica e uma capela de fluxo laminar são necessárias para o Dia 1 do protocolo de ensaio.

1. Preparar diluições de 17β-estradiol para a curva padrão.
   1. Transfira o meio de recuperação celular e o meio de triagem composto (CSM) do freezer e descongele-os em banho-maria a 37 °C.
   2. Rotule os tubos de microcentrífuga Intermediário 1 e 2 (INT1, INT2) e 1-8.
   3. Preencha INT1 com 995 μL de CSM, INT2 com 615 μL de CSM, tubo 1 com 900 μL de CSM e tubos 2-8 com 600 μL de CSM. Coloque o tubo 8 de lado.
   4. Transfira 5 μL de estoque de 100 μM 17β-estradiol para INT1. Descarte a ponta. Vórtice.
   5. Antes de cada transferência, enxágue a pipeta 3 vezes e, em seguida, transfira 10 μL de INT1 para INT2. Descarte a ponta.
   6. Enxágue a pipeta 3 vezes e, em seguida, transfira 100 μL de INT2 para o tubo 1. Descarte a ponta. Transfira 300 μL do tubo 1 para o tubo 2. Repita para os tubos 3 a 7. Descarte 300 μL do tubo 7 no recipiente de resíduos. O tubo 8 é Zero e não recebe estradiol. As concentrações finais dos padrões plaqueados são: 400, 133,3, 44,44, 14,815, 4,938, 1,646, 0,5487 e 0 pM de estradiol.
2. Prepare compostos de amostra.
   1. Amostras de vórtice.
   2. Pegue 4 μL de cada amostra de planta em DMSO e adicione 496 μL de CSM para obter uma solução de DMSO a 0,8%.
3. Descongele rapidamente as células repórteres.
   1. Retire o tubo do meio de recuperação celular do banho-maria a 37 °C. Desinfete a superfície externa com etanol 70%.
   2. Recupere as células repórter do armazenamento a -80 °C e descongele transferindo 10 mL do CRM pré-aquecido para o tubo de células congeladas.
   3. Feche o tubo das células repórter e transfira-as para um banho-maria a 37 ° C por 5-10 min.
   4. Recupere o tubo da Suspensão da Célula Repórter do banho-maria. Inverter o tubo de células várias vezes suavemente para quebrar os agregados de células e produzir uma suspensão homogênea. Limpe a superfície do tubo com etanol a 70%.
4. Revestimento de ensaio.
   1. Dispense 100 μL da Suspensão de Célula Repórter em cada poço usando uma pipeta multicanal.
   2. Dispense 100 μL de amostras em triplicado em poços de ensaio apropriados.
   3. Transfira a placa para uma incubadora a 37 °C, umidificada com 5% de CO₂ por 22-24 h.
5. Descongele o substrato de detecção e o tampão de detecção em uma geladeira escura durante a noite para se preparar para o dia 2.
6. Pouco antes do final da incubação da placa, remova o substrato de detecção e o tampão de detecção da geladeira e coloque-o em uma área com pouca luz até que estejam equilibrados em RT. Uma vez em RT, inverta cada tubo suavemente várias vezes para misturar bem as soluções.
   1. Imediatamente antes da conclusão da incubação, despeje todo o conteúdo do tampão de detecção no tubo do substrato de detecção para criar o reagente de detecção de luciferase. Misture delicadamente para não produzir espuma.
   2. Quando a incubação estiver concluída, inverta a placa para descartar o conteúdo em um recipiente de lixo apropriado. Bata suavemente o prato em uma toalha de papel absorvente limpa para remover as últimas gotas dos poços.
   3. Adicione 100 μL do reagente de detecção de luciferase a cada poço. Deixar a placa de doseador repousar em RT durante 15 min. Não agite a placa.
7. Quantifique a luminescência usando um luminômetro de leitura de placas de 96 poços.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pipeta de 1000 μL
Pipeta de 20 μL
Pipeta de 200 μL
Banho-maria a 37 °C
Incubadora de CO2 a 5% umidificada a 37 °C
70% de etanol
Balança analítica
Capa de fluxo laminar com classificação de cultura de células
Dimetilsulfóxido
Bacia de mídia descartável, estéril
Sistema de filtragem por gotejamento
Balões de Erlenmeyer			125 mL e 250 mL
Metanol de grau HPLC
Sistema de ensaio Human ERβ Reporter, ensaios de formato de 1 x 96 poços	Indigo Biosciences	IB00411	Kit de ensaio - analisa 24 amostras mais curva padrão
Liofilizador
Pipeta multicanal
Agitador orbital
Luminômetro de leitura de placas			ex. Bioteck Synergy HTX
Evaporador rotativo
Balões de fundo redondo			50 mL e 300 mL
Tubos de microcentrífuga estéreis ou bacias de meios multicanal estéreis
Pontas estéreis			200 μL e 1000 μL
Papel de grau 1 do Whatman
Sacos Whirl-pak			sacos de polietileno estéreis