1. Cultura celular
- Mantenha as células em uma incubadora umidificada a 37 ° C / 5% de CO2 e cultura com DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) (células HeLa e A431) ou RPMI suplementado com 15% de FBS (células U266B1). Cultive as células até atingirem 70-80% de confluência, depois tripsinize-as e passe ou use-as para os ensaios.
nota: Os meios de cultura continham vermelho de fenol. Nenhuma falta de soro foi realizada para qualquer linhagem celular antes da realização dos ensaios.
2. Titulação do estimulador ou inibidor usando o protocolo de ensaio de duas placas com células aderentes
NOTA: Este procedimento descreve como determinar as potências do estimulador ou inibidor gerando uma curva concentração-resposta a partir de uma série de diluições do composto de ensaio.
- Semeadura celular
- Dispense 50 μL de células na densidade pré-otimizada (40.000 células HeLa/poço para STAT3 e STAT6; 75.000 células A431/poço para STAT5) em uma placa tratada com cultura de tecidos de 96 poços no meio de cultura apropriado. Incubar durante a noite a 37 °C/5% CO2.
nota: A densidade celular ideal e o tempo de incubação da cultura precisam ser determinados.
- Diluições dos compostos de ensaio
- Preparar séries intermédias de diluição 2x do(s) composto(s) de ensaio, diluindo o(s) composto(s) em série (diluições com intervalo de meio logarítmico) através de 12 alvéolos de uma placa de polipropileno de 96 poços para o meio isento de soro.
nota: Recomenda-se a realização de uma curva concentração-resposta de intervalo de meio log de 12 pontos em pelo menos duplicata para uma estimativa precisa do EC50 ou IC50.
- Alternativamente, para compostos de teste hidrofóbicos solúveis em dimetilsulfóxido (DMSO), realize as diluições iniciais em 100% de DMSO e, em seguida, dilua a série de diluições do composto em um meio livre de soro.
nota: A tolerância do ensaio ao DMSO deve ser estabelecida antes da realização de uma titulação do composto de ensaio num veículo DMSO. É importante manter concentrações iguais de solvente entre as células tratadas e não tratadas. Além disso, ao testar diluições seriadas de compostos, as concentrações de solventes devem permanecer sempre constantes ao longo da série de diluição.
- Tratamento celular
- Para estimulação celular, adicione 50 μL de meio livre de soro sozinho (células não tratadas) ou contendo o estimulador (2x).
- Incubar durante o tempo pré-otimizado à temperatura ambiente (RT) ou a 37 °C (interferão (IFN) α2b/20 min a RT para STAT3; fator de crescimento epidérmico (EGF)/10 min a RT para STAT5; interleucina (IL)-4/20 min a RT para STAT6). Prossiga então para a seção 2.4.
nota: A temperatura ideal de incubação precisa ser determinada.
- Para inibição celular, adicione 25 μL de meio livre de soro sozinho (células não tratadas) ou contendo o inibidor (4x).
- Incubar pelo tempo pré-otimizado em RT ou 37 °C (Inibidor de JAK 1/30 min em RT para STAT3 e STAT6; Erlotinibe/15 min em RT para STAT5).
- Adicionar 25 μL de meio isento de soro sozinho (células não tratadas) ou contendo o estimulador (4x) em seu EC80.
- Incubar durante o tempo pré-otimizado a RT ou a 37 °C (mesmas condições que para o passo 2.3.2).
- Lise celular
- Prepare o 1x Tampão de Lise Suplementado específico do kit conforme indicado pelo fabricante.
nota: É obrigatório suplementar o tampão de lise 1x com o coquetel inibidor de fosfatase 100x diluído até uma concentração final de 1x. O 1x tampão de lise suplementado contém 1 mM de fluoreto de sódio, 2 mM de ortovanadato de sódio e 2 mM de beta-glicerofosfato. Outros inibidores da fosfatase não são necessários e devem ser evitados. Tampões de lise e inibidores de fosfatase diferentes dos incluídos no kit não são recomendados, pois podem conter ingredientes que podem interferir na medição.
- Remover e rejeitar cuidadosamente o meio de cultura de células aspirando o sobrenadante.
- Adicione imediatamente 50 μL de 1x Tampão de Lise Suplementado.
nota: O volume do tampão de lise (25-50 μL) pode ser otimizado.
- Incubar por 30 min em RT sob agitação (agitador de placa orbital ajustado a 400 rpm; agitação moderada).
nota: O tempo de incubação da lise (30-60 min) pode ser otimizado. Os lisados podem ser usados imediatamente para detecção de proteínas-alvo ou congelados a -80 °C.
- Detecção de TR-FRET
- Prepare a mistura de detecção de anticorpos 4x em 1x tampão de detecção conforme indicado pelo fabricante.
- Nesta etapa de transferência, pipete cuidadosamente 15 μL de lisado celular da placa de cultura de 96 poços para um poço de uma microplaca branca de baixo volume de 384 poços.
- Adicione 15 μL do lisado de controle positivo e 15 μL de tampão de lise 1x (controle negativo) para separar os poços de ensaio.
- Adicione 5 μL de mistura de detecção de anticorpos 4x (Eu-Ab1 / FR-Ab2 para detecção da fosfoproteína ou Eu-Ab3 / FR-Ab4 para detecção da proteína total) a cada um dos poços de ensaio.
- Cobrir a placa com um selador de placas e incubar por 1 h até pernoite em RT, dependendo do ensaio (ver Ficha Técnica correspondente).
nota: O tempo de leitura ideal precisa ser otimizado para cada ensaio e linhagem celular. A placa pode ser lida várias vezes sem um efeito negativo no desempenho do ensaio.
- Remova o selador de placas adesivas e leia a placa em um leitor de microplacas compatível com TR-FRET.
nota: Fluorômetros baseados em filtro são recomendados, embora alguns instrumentos monocromadores possam ser usados. Verifique se o módulo óptico apropriado (filtros e espelho) para TR-FRET está instalado. Use um comprimento de onda de excitação de 320 ou 340 nm para excitar o quelato de európio. Ler ensaios a 615 nm (ou 620 nm) e 665 nm para detectar a emissão do európio doador e do fluoróforo aceptor, respectivamente. As configurações do instrumento dependerão do leitor específico. Os dados apresentados aqui foram obtidos usando excitação baseada em lâmpada, atraso de 90 μs, tempo de integração de 300 μs e 100 flashes por poço. O ensaio fosfo-STAT4, no entanto, foi lido usando excitação a laser para gerar relações sinal-fundo (S / B) mais altas.
