Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local
1. Isolamento e cultura de células progenitoras neurais humanas (hNPCs)
- Coloque o tecido cerebral em uma placa de Petri de 100 mm e remova cuidadosamente as meninges usando uma pinça.
- Transfira o tecido cerebral para um tubo cônico de 50 mL e lave-o duas vezes com 20 mL de PBS, invertendo suavemente o tubo.
- Incube o tecido cerebral em um novo tubo cônico de 50 mL submergindo o tecido em solução de dissociação celular (ver Tabela de Materiais) e DNase I (10 U / mL) por 10 min a 37 ° C.
- Adicione 5 mL de meio de cultura de células neuronais (ver Tabela de Materiais) ao tubo contendo tecido cerebral e dissocie mecanicamente as neuroesferas triturando 20 a 30 vezes através de uma ponta de pipeta de 1000 μL para fazer uma suspensão unicelular.
- Filtrar a suspensão celular através de um filtro de células de 70 μm para remover os aglomerados de células.
- Semeie a suspensão unicelular em um frasco T-25 ventilado com 5-10 mL de meio de cultura de células neuronais suplementado com componentes detalhados na Tabela 1.
- Esterilizar a solução de heparina por filtração através de um filtro de 0,2 μm. O suplemento B-27 sem Vitamina A é um suplemento sem soro para o cultivo de progenitores neurais e células-tronco sem induzir diferenciação.
nota: As células progenitoras neurais humanas (hNPCs) são isoladas de um cérebro fetal humano coletado de um feto abortado. Após 7 a 10 dias em cultura, as células-tronco neurais (NSCs) formam colônias de neuroesferas flutuantes, enquanto outros tipos de células permanecem em suspensão como células únicas ou se ligam ao fundo do frasco. Os hNPCs isolados podem ser cultivados como neuroesferas em suspensão por vários meses.
2. Passando os hNPCs
- Coletar os meios contendo as esferas flutuantes, neuroesferas grandes e pequenas, e transferi-los para um tubo cônico de 50 mL.
nota: Por razões desconhecidas, o tempo para dividir as neuroesferas é variável de 7 dias a 30 dias. No entanto, geralmente, as neuroesferas precisam ser passadas quando atingem um diâmetro superior a 700-900 μm. É quando o centro da neuroesfera começa a escurecer, o que é considerado um sinal de alta taxa de morte celular.
- Gire as neuroesferas por centrifugação a 300-400 x g por 3 min.
- Aspirar cuidadosamente o sobrenadante e, em seguida, submergir as esferas em 500 μL de reagente de dissociação celular descongelado (ver Tabela de Materiais).
- Faça alíquotas de reagente de dissociação celular adicionando 500 μL por microtubos de 1,5 mL e armazene a -20 ° C. Para evitar a perda de atividade enzimática, descongele o reagente de dissociação celular mantendo-o em RT ou quente por 5 min em um banho de água/esferas a 37 °C.
- Dependendo da densidade e tamanho das esferas, incubar as esferas submersas a 37 °C por 5-15 min.
- Adicione 5-10 mL de meios de cultura pré-aquecidos às neuroesferas contendo 50 mL de tubo cônico e centrifugue a 300-400 x g por 5 min para sedimentar as neuroesferas.
- Aspire o sobrenadante e pipete suavemente para cima e para baixo, usando uma pipeta de 1000 μL, em 2 mL de meio de cultura até que todas as neuroesferas estejam em uma suspensão unicelular.
nota: A dissociação se tornará visível a olho nu. Antes da dissociação, as neuroesferas estão na forma de esferas. Depois de submergir no reagente de dissociação e pipetar para cima e para baixo, eles se tornarão células únicas.
- Contar e plaquear as células individuais, 2 a 3 milhões de células por balão T-25, em 10 ml de meios de cultura.
- Alimente as células a cada 3 dias, substituindo metade dos meios de cultura.
- Acalme as neuroesferas inclinando o frasco para que fique no canto inferior. Manter o balão na posição durante cerca de 1-2 minutos até que as neuroesferas sedimentem. Em seguida, aspire metade do meio suavemente, inserindo a pipeta sorológica no meio acima das neuroesferas estabelecidas. As células dissociadas podem se agregar para formar esferas após 2 a 3 dias em cultura.
3. Congelando os hNPCs
- Prepare o meio de congelamento celular adicionando DMSO ao meio de cultura até uma concentração final de 10% (v / v) ou use um meio de criopreservação disponível comercialmente para tipos de células sensíveis (consulte a Tabela de Materiais).
- Separe as esferas grandes transferindo a mídia para um tubo cônico de 50 mL e deixando as esferas assentarem por gravidade. Em seguida, remova e transfira as grandes neuroesferas para um novo tubo cônico de 50 mL para passagem usando uma ponta pipetada de 200 ou 1000 μL.
nota: As neuroesferas com diâmetro superior a 900 μm são consideradas grandes, e as com diâmetro menor que 500 μm são consideradas pequenas.
- Gire as neuroesferas restantes por centrifugação a 300-400 x g por 3 min. Remova cuidadosamente o sobrenadante.
- Ressuspenda até 100 esferas em 1 mL de reagente de criopreservação e transfira-o para um criotubo.
- Armazene durante a noite a -80 °C em um recipiente de congelamento de células (consulte a Tabela de Materiais) e mova-o para nitrogênio líquido no dia seguinte para armazenamento de longo prazo.
nota: É preferível congelar neuroesferas de pequeno a médio porte (menos de 900 μm de diâmetro) e evitar o congelamento de neuroesferas de grande porte (mais de 900 μm de diâmetro) ou células individuais. Para reduzir o dano celular durante o descongelamento da amostra, mantenha as células densas semeando as neuroesferas descongeladas em um pequeno frasco T25.
4. Avaliação da neurotoxicidade
NOTA: A citotoxicidade dos compostos de teste é avaliada em placas de 384 poços (consulte a Tabela de Materiais) usando um ensaio de viabilidade de células luminescentes (consulte a Tabela de Materiais). Os hNPCs são preparados seguindo o mesmo método, exceto por pequenas modificações, descritas na seção "Diferenciação e Tratamento de hNPCs". Posteriormente, um sinal luminescente gerado pelo ensaio de viabilidade celular luminescente é medido utilizando um leitor de microplacas. O sinal luminescente é proporcional à concentração de ATP celular, que por sua vez é diretamente proporcional ao número de células viáveis presentes em cada poço.
- revestimento
- Adicione 30 μL de poli-L-lisina (PLL) por poço de uma placa de 384 poços.
- Incubar por 1 h em RT.
- Lave 2x com PBS.
- Deixe secar em RT (por cerca de 30 min).
- Adicione 30 μL de laminina (50 μg/mL) por alvéolo de uma placa de 384 poços.
- Incubar durante 2 h a 37 °C.
- Lave 2x com PBS.
nota: As placas revestidas de 384 poços podem ser armazenadas a 4 °C por 1 mês.
- Revestimento das células
- Conte e coloque 20.000 neuroesferas unicelulares por poço de uma placa de 384 poços em 25 μL de meios de diferenciação.
- Incubar durante 5 dias a 37 °C.
- Após 5 dias, trate as células durante 24 h com compostos de ensaio preparados a 6x a concentração final desejada em 5 μL de volume (para perfazer o volume final de 30 μL por alvéolo).
- Ensaio de viabilidade celular
- Adicione 30 μL de reagente de ensaio de viabilidade celular luminescente por poço de uma placa de 384 poços.
nota: Adicione um volume de reagente de ensaio de viabilidade celular luminescente igual ao volume presente em cada poço. Descongelar o reagente do ensaio de viabilidade celular luminescente e equilibrá-lo em RT antes da utilização.
- Agite em um agitador de pratos por 2 minutos (para misturar e induzir a lise celular).
- Gire a mistura por centrifugação a 300-400 x g por 30 s.
- Incube a placa de 384 poços por 10 min em RT em um local protegido da luz (para estabilizar o sinal luminescente).
- Registre a luminescência com um leitor de microplacas.
nota: Utilizar controlos adequados para o ensaio de viabilidade, incluindo Velcade (a uma concentração final de 10 μM) como positivo e HBSS contendo DMSO (com uma concentração final de 0,1% ou 0,2%) como controlo negativo.
Tabela 1. Componentes necessários para a confecção de 100 mL de meios de cultura
| quantidade | componente |
| 100 μL | EGF (20 ng/mL) |
| 100 μL | FGF (10 ng/mL) |
| 2 mL | B-27, menos vitamina A (50X) |
| 1 mL | L-alanil-L-glutamina (100X) (ver tabela de materiais) |
| 4 μL | Heparina (2 μg/mL) |
| 96,8 mL | Meio de cultura de células neuronais (ver tabela de materiais) |
