Não há conflitos de interesse declarados.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Lamínulas circulares de 18 mm</td>
			<td>Thermo Científico</td>
			<td>CB00180RA</td>
			<td>Esterilize antes de usar</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citocalasina D</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>PHZ1063</td>
			<td>Dissolvido em DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kit Maxi Plasmídeo EndoFree</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>Rolamento 12362</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Meio de montagem de fluorescência</td>
			<td>Dako</td>
			<td>S302380</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Reagente de Transfecção de Lipofectamina 2000</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>11668019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldeído</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Pág. 6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pEGFP-C1</td>
			<td>Clontech</td>
			<td>#6084-1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pCI FE65</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Consulte as referências 8 e 15</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tablets PBS</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>18912014</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicilina-estreptomicina</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bromidrato de poli-D-lisina</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Pág. 7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>espátula</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S4147</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>25300062</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

ensaio de imunofluorescência para avaliar o efeito de proteínas-alvo no crescimento de neuritos

Fonte: Chan, W., W., R. et al. <a href="https://app.jove.com/v/60031">Um ensaio baseado em proteína de fluorescência verde aprimorada para estudar o crescimento de neuritos em neurônios primários.</a> J. Vis. Exp. (2019).
Neste vídeo, demonstramos um ensaio de imunofluorescência baseado em EGFP para identificar a eficácia das proteínas-alvo no crescimento de neuritos de neurônios corticais primários. Os neurônios primários são transfectados com uma proteína fluorescente, EGFP, e uma proteína-alvo e, em seguida, um imunoensaio é realizado para investigar o efeito da proteína-alvo no crescimento de neuritos.

Ensaio de imunofluorescência para avaliar o efeito de proteínas-alvo no crescimento de neuritos

Fonte: Chan, W., W., R. et al. Um ensaio aprimorado baseado em proteína de fluorescência verde para estudar o crescimento de neuritos em neurônios primários. J. Vis. Exp. 
...

Os neurônios em desenvolvimento estendem os processos citoplasmáticos de seus corpos celulares por crescimento de neuritos para desenvolver dendritos e axônios, que são essenciais para a comunicação neurônio a neurônio.
Para estudar o efeito de uma proteína-alvo no crescimento de neuritos, pegue uma placa multipoços com uma lamínula revestida com poli-D-lisina em sua base. A superfície da lamínula tem uma cultura aderente de neurônios corticais primários derivados do cérebro embrionário de ratos.
Trate os neurônios com uma mistura contendo dois tipos de plasmídeos - um plasmídeo EGFP que codifica a proteína fluorescente verde aprimorada e um segundo plasmídeo que codifica a proteína-alvo em um reagente de transfecção adequado.
O reagente de transfecção facilita a entrada dos plasmídeos nas células.
Após a transfecção, ambos os plasmídeos são expressos, produzindo proteínas fluorescentes verdes e proteínas-alvo. A expressão de EGFP confere fluorescência verde às células co-transfectadas.
As proteínas-alvo com potencial estimulador do crescimento de neuritos iniciam a sinalização celular, que promove a reorganização do citoesqueleto e leva ao desenvolvimento de projeções neuronais e suas extensões.
Aspire o meio gasto e fixe as células com paraformaldeído. Contra-core as células usando anticorpos anti-proteína alvo marcados com fluorescência vermelha que se ligam especificamente às proteínas-alvo expressas e conferem fluorescência vermelha adicional às células.
Remova a lamínula da placa de cultura e observe-a sob um microscópio de fluorescência.
As células co-transfectadas exibindo um sinal de fluorescência de duas cores mostram processos neuronais mais longos do que as células sem fluorescência vermelha, confirmando o efeito estimulante da proteína-alvo no crescimento de neuritos.

Após dois dias a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono, dilua os DNAs de plasmídeo EGFP e proteína-alvo e o reagente de transfecção em dois tubos separados de 1,5 mililitro e, em seguida, misture-os. Transfecte as células com EGFP construindo adicionando a mistura de transfecção aos poços.
Após 24 horas, lave as células com PBS a 37 graus Celsius e fixe-as com paraformaldeído a 4% em PBS por 10 minutos no escuro à temperatura ambiente.
No final da incubação, lave as células fixadas três vezes com PBS fresco por lavagem e adicione um volume mínimo de meio de montagem de fluorescência em uma lâmina de vidro do microscópio, por amostra. Em seguida, transfira cuidadosamente as lamínulas revestidas para o meio de montagem, com as amostras voltadas para as lâminas de vidro.
Para obter imagens do crescimento de neuritos, selecione a objetiva de 40x em um microscópio epifluorescente e clique em "Iniciar" para capturar imagens de pelo menos 40 neurônios positivos para EGFP intactos por transfecção.
Quando todos os novos direitos tiverem sido criados, abra as imagens capturadas no ImageJ com o plug-in NeuronJ e meça o comprimento do neurite mais longo de cada neurônio do corpo celular até a ponta do cone de crescimento. Em seguida, analise os dados obtidos com o software, para determinar o efeito das proteínas-alvo no crescimento de neuritos.

immunofluorescence-assay-to-evaluate-effect-target-proteins-on

Research

JoVE Encyclopedia of Experiments

Biological Techniques

Técnicas Biológicas

Assay Techniques

Técnicas de Ensaio

Immunoassays

Imunoensaios

Immunofluorescence Assay to Evaluate Effect of Target Proteins on Neurite Outgrowth

993 visualizações. Os neurônios em desenvolvimento estendem os processos citoplasmáticos de seus corpos celulares por crescimento de neuritos para desenvolver dendritos e axônios, que são essenciais para a comunicação neurônio a neurônio. Para estudar o efeito de uma proteína-alvo no crescimento de neuritos, pegue uma placa multipoços com uma lamínula revestida com poli-D-lisina em sua base. A superfície da lamínula tem uma cultura aderente de neurônios corticais primários derivados do cé...

Ensaio de imunofluorescência para avaliar o efeito de proteínas-alvo no crescimento de neuritos

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Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Lamínulas circulares de 18 mm	Thermo Científico	CB00180RA	Esterilize antes de usar
Citocalasina D	Invitrogen	PHZ1063	Dissolvido em DMSO
Kit Maxi Plasmídeo EndoFree	QIAGEN	Rolamento 12362
Meio de montagem de fluorescência	Dako	S302380
Reagente de Transfecção de Lipofectamina 2000	Invitrogen	11668019
Paraformaldeído	Sigma-Aldrich	Pág. 6148
pEGFP-C1	Clontech	#6084-1
pCI FE65			Consulte as referências 8 e 15
Tablets PBS	Gibco	18912014
Penicilina-estreptomicina	Gibco	15140122
Bromidrato de poli-D-lisina	Sigma-Aldrich	Pág. 7280
espátula	Sigma-Aldrich	S4147
Tripsina-EDTA (0,05%), vermelho de fenol	Gibco	25300062