Ensaio de complementação de luciferase dividida para identificar interações proteína-proteína específicas

Abstract

Fonte: Wiertelak, W. et.al., Demonstração de Complexos Heterólogos formados por Proteínas de Membrana Tipo III Residentes em Golgi usando Ensaio de Complementação de Luciferase Dividida. J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demonstra o ensaio de complementação de luciferase dividida para detectar interações proteína-proteína. Neste ensaio, as proteínas de interesse são marcadas em pequenos e grandes fragmentos da enzima luciferase. Quando as proteínas interagem, os fragmentos grandes e pequenos se combinam para formar um complexo enzimático ativo, que na presença de um substrato específico, libera luminescência brilhante que pode ser medida.

Protocol

1. Transfecção transitória dos plasmídeos de expressão nas células

1. Colha o aderente HEK293T cultura de células por tripsinização e ressuspenda as células em um meio de crescimento completo dedicado. Coloque as células (2 x 10⁴/100 μL / poço) em uma placa de fundo transparente e lado branco de 96 poços. Ajuste o número total de poços para acomodar todas as combinações e controles testados, incluindo replicates.
   nota: Tente usar apenas os 60 poços internos da placa para minimizar as mudanças térmicas e evitar a evaporação durante a noite. O uso de placas revestidas de poli-D-lisina é altamente recomendado, como as indicadas na Tabela de Materiais, caso contrário, as células podem se soltar durante as etapas de lavagem subsequentes.
2. Cultivar as células durante a noite em condições normais (37 °C, 5% CO₂).
3. No dia seguinte, transfecte as células com as combinações desejadas de plasmídeos de expressão.
   1. Dilua os plasmídeos de expressão em um meio isento de soro (consulte a Tabela de Materiais) a 6,25 ng/μL para cada construção.
   2. Adicione o reagente de transfecção à base de lipídios em uma proporção apropriada de lipídios para DNA e incube de acordo com as instruções do fabricante.
   3. Adicione 8 μL de lipídio: mistura de DNA aos poços designados. Misture o conteúdo da placa por rotação suave. Isso resulta na transfecção de ambas as construções de expressão a 50 ng / poço.
4. Cultive as células por 20-24 h em condições padrão (37 °C, 5% CO₂).
   nota: A cultura das células por mais tempo pode resultar em níveis mais altos de expressão da proteína de fusão, o que pode promover uma associação não específica entre os fragmentos.

2. Troca média

1. No dia seguinte, substitua o meio condicionado por 100 μL de meio isento de soro em cada poço. Certifique-se de que as células não se desprenderam na troca do meio.
   nota: Esta etapa deve ser feita 2-3 h antes da adição da solução de trabalho de furimazina. A retirada do soro minimiza o fundo causado pela autoluminescência da furimazina.

3. Preparação da solução de trabalho de furimazina

1. Imediatamente antes da medição, misture 1 volume de furimazina com 19 volumes de um tampão de diluição (uma diluição de 20 vezes).
   nota: O volume total da solução de trabalho de furimazina a ser preparada depende do número de alvéolos individuais a serem analisados (a solução de trabalho de furimazina é adicionada ao meio de cultura de células na proporção de 1:5, portanto, a cada poço previamente preenchido com 100 μL de um meio isento de soro devem ser adicionados 25 μL da solução de trabalho de furimazina).
2. Adicione a solução de trabalho de furimazina aos poços designados (25 μL / poço). Misture suavemente a placa manualmente ou usando um agitador orbital (por exemplo, 15 s a 300-500 rpm).

4. Medindo a luminescência

1. Insira a placa em um leitor de microplacas de luminescência.
   1. Para experimentos a serem realizados a 37 ° C, equilibre a placa por 10-15 min na temperatura indicada.
2. Selecione os poços a serem analisados.
3. Leia a luminescência com um tempo de integração de 0,3 s. Continue monitorando a luminescência por até 2 h quando necessário.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solução de tripsina-EDTA a 0,25%			Cultura de células
Linhagem celular de mamíferos aderente			Cultura de células
BioCoat Poly-D-Lysine 96 poços Branco/Transparente Fundo Plano TC-tratado Microplaca, com Tampa	Corning	356651	Artigos de plástico
Centrífuga para cultura celular			Artigos de plástico
Suplementos de cultura celular (soro fetal bovino inativado pelo calor, L-glutamina, penicilina, estreptomicina)			Cultura de células
Incubadora de CO2			dispositivo
Plasmídeos de expressão que codificam proteína(s) de interesse não marcados com fragmentos de NanoBiT			Análise
Reagente de transfecção FuGENE HD	Promega	E2311	Análise
Leitor de microplacas GloMax Discover (ou um leitor de microplacas de luminescência diferente)	Promega	GM3000	dispositivo
Meio de crescimento dedicado à linhagem celular utilizada			Cultura de células
Materiais e reagentes para clonagem molecular padrão (bactérias, polimerase termoestável, enzimas de restrição, DNA ligase, materiais e reagentes para purificação de ácidos nucleicos)			Análise
Sistema de partida NanoBiT MCS	Promega	N2014	Este kit contém vetores que permitem a marcação das proteínas de interesse com fragmentos de NanoBiT em diferentes orientações, bem como o plasmídeo de controle que codifica a proteína HaloTag fundida com SmBiT e um par de plasmídeos de controle positivo.
Sistema de ensaio de células vivas Nano-Glo	Promega	N2011	Este kit contém furimazina, que é um substrato que permite a detecção da atividade do NanoLuc em células vivas, e um tampão de diluição dedicado.
Opti-MEM I Medium Sérico Reduzido, sem vermelho de fenol	Gibco	11058021	Cultura de células
Agitador orbital			dispositivo