Ensaio de eletroquimioluminescência para quantificação dos níveis de proteína-alvo no lisado cerebral

Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE

1. Protocolo MeCP2-ECLIA

1. Preparação da solução de lavagem, tampão de bloqueio e solução diluente de ensaio (dia 1)
   1. Adicione 500 μL de Tween 20 a 1 L de PBS para preparar uma solução de Tween 20 a 0,05% em PBS, misture vigorosamente e rotule como "solução de lavagem".
      nota: Certifique-se de que apenas o tampão de lavagem recém-preparado seja usado.
   2. Prepare uma solução de bloqueio do bloqueador A a 3% (Tabela de Materiais) em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Misture mexendo suavemente, filtre esterilize e guarde na geladeira até o uso por no máximo duas semanas.
   3. Adicione 5 mL de solução de bloqueio a 10 mL de PBS para preparar a solução diluente do ensaio (bloqueador A a 1% em PBS).
2. Revestimento de placas de alta ligação
   1. Retire uma placa de alta ligação de ponto único de 96 poços multi-array.
      nota: As placas de alta ligação têm uma maior capacidade de ligação e, portanto, uma faixa dinâmica maior do que as placas padrão com superfícies hidrofóbicas.
   2. Descongele o anticorpo monoclonal anti-MeCP2 de camundongo em gelo e misture 0,67 μL do anticorpo com 4 mL de PBS (diluição de 1:6.000 de anticorpos em PBS). Vortex a solução de anticorpos para misturar bem e rotular o tubo como "solução de revestimento".
   3. Dispense cuidadosamente 25 μL de solução de revestimento no canto inferior de cada poço usando um pipetador multicanal; isso é chamado de método de revestimento de solução. Bata suavemente na placa de 96 poços de cada lado para garantir que a solução de revestimento cubra o fundo de cada poço.
   4. Feche a placa com uma folha adesiva e incube a placa na geladeira a 4 ° C durante a noite (12 a 16 h).
3. Bloqueio (dia 2)
   1. Retire o prato da geladeira e retire o papel alumínio.
   2. Remova a solução de revestimento de anticorpos jogando-a na cesta de lixo e bata a placa em uma toalha de papel para remover toda a solução de revestimento dos poços.
   3. Adicione 125 μL de solução de bloqueio por poço. Feche a placa novamente e coloque-a em um agitador de microplacas orbital.
   4. Incubar a placa durante 90 min à temperatura ambiente com agitação constante a 800 rpm.
4. Preparações de padrões e amostras
   1. Durante o tempo de incubação, preparar os padrões proteicos MeCP2 e/ou TAT-MeCP2 e várias amostras.
      nota: O tampão de lise utilizado para a diluição-padrão deve ser o mesmo utilizado nas amostras analisadas.
   2. Retire um frasco de MePC2 e / ou solução de estoque de proteína TAT-MeCP2 (250 μg / mL), lisados de cérebro de camundongo e lisados de HDF a -80 ° C. Descongele-os no gelo.
   3. Diluir a solução-mãe padrão (MeCP2 e/ou TAT-MeCP2) em tubos limpos de acordo com a Tabela 1.
   4. Dilua as amostras em tampão de lise da seguinte forma: 1−20 μg de lisado cerebral de camundongo por 25 μL de tampão de lise e 0,25−1 μg de lisado HDF por 25 μL de tampão de lise. Preparar volume suficiente de cada amostra para efectuar a análise em triplicata.
5. Adicionando as amostras e soluções padrão
   1. Remova a solução de bloqueio jogando-a na cesta de lixo e bata o prato em uma toalha de papel para remover toda a solução de bloqueio dos poços.
   2. Lave a placa 3x com 150 μL de solução de lavagem adicionando a solução de lavagem e removendo-a imediatamente.
   3. Adicione 25 ul de padrões e amostras no canto inferior do poço usando uma pipeta de canal único.
   4. Feche a placa e incube-a durante 4 h à temperatura ambiente com agitação constante a 800 rpm.
6. Anticorpo de detecção não marcado
   1. Descongele o anticorpo policlonal anti-MeCP2 de coelho no gelo. Diluir o anticorpo 1:6.000 em solução diluente de ensaio.
   2. Remova os padrões e amostras jogando-os na cesta de lixo e bata no prato em uma toalha de papel.
   3. Lave a placa 3x com 150 μL de solução de lavagem adicionando a solução de lavagem e removendo-a imediatamente.
   4. Adicione 25 μL de anticorpo de detecção não marcado a cada poço com o pipetador multicanal. Feche a placa e incube-a durante 1 h com agitação constante a 800 rpm à temperatura ambiente.
7. Anticorpo conjugado específico
   1. Retire o anticorpo secundário específico (Tabela de Materiais) da geladeira e coloque-o no gelo. Diluir o anticorpo 1:666.67 em solução diluente de ensaio e misturar suavemente.
   2. Remova o anticorpo secundário livre não rotulado jogando-o na cesta de lixo e bata no prato em uma toalha de papel.
   3. Lave a placa 3x com 150 μL de solução de lavagem adicionando a solução de lavagem e removendo-a imediatamente.
   4. Adicione 25 μL de anticorpo conjugado específico (Tabela de Materiais) a cada poço com o pipetador multicanal. Feche a placa e incube por 1 h com agitação constante a 800 rpm à temperatura ambiente.
8. Lendo o prato
   1. Remova o anticorpo conjugado livre (Tabela de Materiais) jogando-o na cesta de lixo e bata com o prato em uma toalha de papel.
   2. Lave a placa 3x com 150 μL de solução de lavagem.
   3. Adicione 150 μL de 1x tampão de leitura de ouro à base de Tris (Tabela de Materiais) com surfactante contendo tripropilamina como co-reagente para geração de luz na placa. Evite bolhas de ar usando técnicas de pipetagem reversa.
   4. Coloque a placa na plataforma de detecção de microplacas (Tabela de Materiais) e inicie a medição imediatamente. Use as configurações para aquisição de placas de 96 poços.
   5. Capture os sinais de eletroquimioluminescência por uma câmera CCD embutida em um sistema de detecção de eletroquimioluminescência (Tabela de Materiais) e registre as contagens de sinais, que correspondem a unidades de luz relativa (RLU) e são diretamente proporcionais à intensidade da luz.
      nota: Após estimulação eletroquímica, o rótulo de rutênio ligado ao eletrodo de carbono emite luz de luminescência a 620 nm. Analise os dados com o software acompanhado do instrumento (Tabela de Materiais).

Tabela 1: Série padrão de 0 a 1.800 ng/mL.