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Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE
1. Protocolo MeCP2-ECLIA
- Preparação da solução de lavagem, tampão de bloqueio e solução diluente de ensaio (dia 1)
- Adicione 500 μL de Tween 20 a 1 L de PBS para preparar uma solução de Tween 20 a 0,05% em PBS, misture vigorosamente e rotule como "solução de lavagem".
nota: Certifique-se de que apenas o tampão de lavagem recém-preparado seja usado.
- Prepare uma solução de bloqueio do bloqueador A a 3% (Tabela de Materiais) em solução salina tamponada com fosfato (PBS). Misture mexendo suavemente, filtre esterilize e guarde na geladeira até o uso por no máximo duas semanas.
- Adicione 5 mL de solução de bloqueio a 10 mL de PBS para preparar a solução diluente do ensaio (bloqueador A a 1% em PBS).
- Revestimento de placas de alta ligação
- Retire uma placa de alta ligação de ponto único de 96 poços multi-array.
nota: As placas de alta ligação têm uma maior capacidade de ligação e, portanto, uma faixa dinâmica maior do que as placas padrão com superfícies hidrofóbicas.
- Descongele o anticorpo monoclonal anti-MeCP2 de camundongo em gelo e misture 0,67 μL do anticorpo com 4 mL de PBS (diluição de 1:6.000 de anticorpos em PBS). Vortex a solução de anticorpos para misturar bem e rotular o tubo como "solução de revestimento".
- Dispense cuidadosamente 25 μL de solução de revestimento no canto inferior de cada poço usando um pipetador multicanal; isso é chamado de método de revestimento de solução. Bata suavemente na placa de 96 poços de cada lado para garantir que a solução de revestimento cubra o fundo de cada poço.
- Feche a placa com uma folha adesiva e incube a placa na geladeira a 4 ° C durante a noite (12 a 16 h).
- Bloqueio (dia 2)
- Retire o prato da geladeira e retire o papel alumínio.
- Remova a solução de revestimento de anticorpos jogando-a na cesta de lixo e bata a placa em uma toalha de papel para remover toda a solução de revestimento dos poços.
- Adicione 125 μL de solução de bloqueio por poço. Feche a placa novamente e coloque-a em um agitador de microplacas orbital.
- Incubar a placa durante 90 min à temperatura ambiente com agitação constante a 800 rpm.
- Preparações de padrões e amostras
- Durante o tempo de incubação, preparar os padrões proteicos MeCP2 e/ou TAT-MeCP2 e várias amostras.
nota: O tampão de lise utilizado para a diluição-padrão deve ser o mesmo utilizado nas amostras analisadas.
- Retire um frasco de MePC2 e / ou solução de estoque de proteína TAT-MeCP2 (250 μg / mL), lisados de cérebro de camundongo e lisados de HDF a -80 ° C. Descongele-os no gelo.
- Diluir a solução-mãe padrão (MeCP2 e/ou TAT-MeCP2) em tubos limpos de acordo com a Tabela 1.
- Dilua as amostras em tampão de lise da seguinte forma: 1−20 μg de lisado cerebral de camundongo por 25 μL de tampão de lise e 0,25−1 μg de lisado HDF por 25 μL de tampão de lise. Preparar volume suficiente de cada amostra para efectuar a análise em triplicata.
- Adicionando as amostras e soluções padrão
- Remova a solução de bloqueio jogando-a na cesta de lixo e bata o prato em uma toalha de papel para remover toda a solução de bloqueio dos poços.
- Lave a placa 3x com 150 μL de solução de lavagem adicionando a solução de lavagem e removendo-a imediatamente.
- Adicione 25 ul de padrões e amostras no canto inferior do poço usando uma pipeta de canal único.
- Feche a placa e incube-a durante 4 h à temperatura ambiente com agitação constante a 800 rpm.
- Anticorpo de detecção não marcado
- Descongele o anticorpo policlonal anti-MeCP2 de coelho no gelo. Diluir o anticorpo 1:6.000 em solução diluente de ensaio.
- Remova os padrões e amostras jogando-os na cesta de lixo e bata no prato em uma toalha de papel.
- Lave a placa 3x com 150 μL de solução de lavagem adicionando a solução de lavagem e removendo-a imediatamente.
- Adicione 25 μL de anticorpo de detecção não marcado a cada poço com o pipetador multicanal. Feche a placa e incube-a durante 1 h com agitação constante a 800 rpm à temperatura ambiente.
- Anticorpo conjugado específico
- Retire o anticorpo secundário específico (Tabela de Materiais) da geladeira e coloque-o no gelo. Diluir o anticorpo 1:666.67 em solução diluente de ensaio e misturar suavemente.
- Remova o anticorpo secundário livre não rotulado jogando-o na cesta de lixo e bata no prato em uma toalha de papel.
- Lave a placa 3x com 150 μL de solução de lavagem adicionando a solução de lavagem e removendo-a imediatamente.
- Adicione 25 μL de anticorpo conjugado específico (Tabela de Materiais) a cada poço com o pipetador multicanal. Feche a placa e incube por 1 h com agitação constante a 800 rpm à temperatura ambiente.
- Lendo o prato
- Remova o anticorpo conjugado livre (Tabela de Materiais) jogando-o na cesta de lixo e bata com o prato em uma toalha de papel.
- Lave a placa 3x com 150 μL de solução de lavagem.
- Adicione 150 μL de 1x tampão de leitura de ouro à base de Tris (Tabela de Materiais) com surfactante contendo tripropilamina como co-reagente para geração de luz na placa. Evite bolhas de ar usando técnicas de pipetagem reversa.
- Coloque a placa na plataforma de detecção de microplacas (Tabela de Materiais) e inicie a medição imediatamente. Use as configurações para aquisição de placas de 96 poços.
- Capture os sinais de eletroquimioluminescência por uma câmera CCD embutida em um sistema de detecção de eletroquimioluminescência (Tabela de Materiais) e registre as contagens de sinais, que correspondem a unidades de luz relativa (RLU) e são diretamente proporcionais à intensidade da luz.
nota: Após estimulação eletroquímica, o rótulo de rutênio ligado ao eletrodo de carbono emite luz de luminescência a 620 nm. Analise os dados com o software acompanhado do instrumento (Tabela de Materiais).
Tabela 1: Série padrão de 0 a 1.800 ng/mL.
| padrão | concentração | diluição |
| Padrão 1 | 1.800 ng/mL | 1,08 μL de solução-mãe padrão + 148,92 μL de tampão de lise |
| Padrão 2 | 600 ng/mL | 50 μL Padrão 1 + 100 μL Tampão de lise |
| Padrão 3 | 200 ng/mL | 50 μL Padrão 2 + 100 μL Tampão de lise |
| Padrão 4 | 66,67 ng/mL | 50 μL Padrão 3 + 100 μL Tampão de lise |
| Padrão 5 | 22,22 ng/mL | 50 μL Tampão de lise padrão 4 + 100 μL |
| Padrão 6 | 7,41 ng/mL | 50 μL Tampão de lise padrão 5 + 100 μL |
| Padrão 7 | 2,47 ng/mL | 50 μL Padrão 6 + 100 μL Tampão de lise |
| Padrão 8 | 0,82 ng/mL | 50 μL Padrão 7 + 100 μL Tampão de lise |
| Padrão 9 | 0,27 ng/mL | 50 μL Padrão 8 + 100 μL Tampão de lise |
| Padrão 10 | 0 ng/mL | Tampão de lise de 150 μL |