Reação em cadeia da polimerase de gotículas digitais para detecção de mutação Indel em genes-alvo

Resumo

Fonte: Carballar-Lejarazú, R., et al. Digital-Droplet PCR para detectar mutações de Indels em populações de mosquitos anofelinos geneticamente modificados. J. Vis. Exp. (2021).

Este vídeo demonstra o papel da reação em cadeia da polimerase de gotículas digitais na identificação da mutação indel em uma amostra de DNA. A alta precisão e sensibilidade do ddPCR permitem a detecção precisa e consistente de mutações raras presentes em uma amostra, mesmo em níveis baixos. Ele pode identificar e quantificar mutações indel em diferentes regiões do genoma, fornecendo informações valiosas sobre os mecanismos de mutação e as consequências funcionais dessas mutações.

Protocolo

1. Reações de ddPCR e preparação para geração de gotículas

1. Quantifique o DNA usando um fluorômetro.
   nota: Para o ensaio de queda, recomenda-se usar uma faixa de 3.000 a 30.000 cópias do genoma haplóide por reação, que é projetada para detectar eventos NHEJ com uma sonda de marcação HEX que se liga a uma sequência WT do local de corte alvo e não recozerá (queda) se houver uma deleção ou inserção no local alvo, indicando a presença de uma variante NHEJ.
2. Calcule o número de cópias usando o peso do genoma haplóide e a concentração de DNA no extrato. Isso é feito multiplicando a concentração do DNA extraído pelo volume usado para obter a massa total do DNA e, em seguida, dividindo-o pelo peso do genoma haplóide. Certifique-se de que o volume adicionado esteja entre 1-10 μL. Dilua conforme necessário para estar na faixa de cópia do genoma haploide recomendada.
   nota: Um genoma haplóide de Anopheles gambiae é estimado em 0,27 pg por mosquito adulto.
3. Projete primers e sondas. Projete primers de oligonucleotídeos diretos e reversos com uma temperatura de fusão do primer (Tm) na faixa de 55-60 ° C que flanqueiam as extremidades 5 '- e 3' do local alvo do gRNA, produzindo um amplicon de 150-400 bp.
   1. Sonda marcada com HEX (hexaclorofluoresceína) para detecção de NHEJ: Projete um oligonucleotídeo de ~ 15-20 pb de comprimento complementar ao local alvo e adicione a sonda HEX à extremidade 5' e BHQ1 (BLack Hole Quencher 1) à extremidade 3'. O Tm da sonda de hidrólise deve ser 3-10 °C mais alto que o Tm dos primers.
   2. Sonda marcada com FAM (6-carboxifluoresceína) para referência WT: Projete um oligonucleotídeo ~ 15-20 pb de comprimento complementar a um local do genoma conservado distante (cerca de 25 pb) do local alvo e adicione a sonda FAM à extremidade 5' e BHQ1 à extremidade 3'. O Tm da sonda de hidrólise deve ser 3-10 °C mais alto que o Tm dos primers.

2. Preparação da reação de PCR

1. Prepare 25 μL da mistura de amostras ddPCR com os seguintes componentes: supermistura ddPCR para sondas (sem UTP): 12,5 μL, primers diretos e reversos (10 μM): 1 μL cada, sondas HEX/FAM (10 μM): 0,625 μL cada, DNA: 1-5 μL (3.750-37.500 cópias do genoma haplóide) e água: até 25 μL.
2. Misture bem as reações por vórtice ou pipetagem de refluxo (para cima e para baixo) (20x).
   nota: Se as reações estiverem em uma placa de 96 poços, pipete todo o volume para cima e para baixo 20 vezes, em vez de vórtice para evitar a formação de bolhas.
3. Centrifugue brevemente as amostras para assentar a mistura no fundo do tubo ou poço.
   nota: Certifique-se de que as reações estejam em temperatura ambiente para a geração de gotículas. Prepare 1x de mistura de ddPCR para poços extras/não utilizados em cada cartucho (cada cartucho tem 8 poços).

3. Geração de gotículas

1. Usando uma pipeta multicanal de 50 μL, carregue 20 μL da mistura de amostras de ddPCR na linha intermediária do cartucho (Figura 1A, superior).
2. Carregue 70 μL do óleo na linha inferior. Carregue 20 μL de supermix 1x ddPCR em poços não utilizados.
   nota: Não introduza bolhas.
3. Coloque a gaxeta tocando apenas as bordas, evitando a área côncava central (Figura 1B).
4. Coloque a placa firmemente no gerador de gotículas e feche a tampa para iniciar a corrida.
5. Usando a pipeta multicanal, transfira 40 μL da mistura de emersão da linha superior do cartucho (Figura 1A, inferior) para a placa de 96 poços.
   1. Retire a amostra líquida durante 3-5 s num ângulo de 45-30°. Expulse a mistura lentamente por mais de 3 s em um ângulo de 45° na lateral do poço, deixando-a escorrer pela lateral. Não há problema em ir para a segunda parada (expulsão completa) da pipeta para expelir todo o líquido.
6. Usando selos térmicos de alumínio, sele as placas por 5 s a 180 °C.

4. PCR

1. Coloque a placa selada no termociclador (Figura 1C) e defina as condições de PCR recomendadas se seguir as diretrizes de entrega do NHEJ da seguinte forma:
   1. Desnaturação inicial a 95 °C por 10 min.
   2. Defina 40 ciclos de 94 °C por 30 s para desnaturar, 55 °C por 1 min para recozer e 60 °C por 2 min para estender.
   3. Mantenha a 98 °C por 10 min.
   4. Manter a 4 °C.
      nota: A temperatura de recozimento para primers específicos e conjuntos de sondas pode ser otimizada usando um gradiente térmico. Use uma taxa de rampa de 2 °C/s para todas as etapas. As condições de PCR devem ser ajustadas dependendo de cada projeto experimental e configuração.

5. Leitura de gotículas

1. Coloque a placa firmemente no leitor de gotículas com o poço A-1 no canto superior esquerdo (canto alisado, os outros três são bordados) (Figura 1D).
2. Configure a placa no programa: Designando FAM como o canal de referência conhecido e HEX como o desconhecido (Figura 2A).
3. Execute o experimento de leitura de gotículas como quantificação direta. Após a conclusão da execução, altere o tipo de experimento para Drop-Off (DOF) para a análise (Figura 2A).

Resultados

Figura 1: Configuração e procedimento experimental. (A) Preparação do cartucho para geração de gotículas. (Início) As amostras são preenchidas na linha do meio do cartucho, enquanto o óleo é preenchido na linha inferior. (Abaixo) Linha superior preenchida com gotículas emulsionadas após a geração de gotículas. (B) Gerador de gotículas com um cartucho cheio de amostra...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagentes
ddPCR Super Mix para sondas (sem dUTP)	Bio-Rad	1863024
EDTA (pH 8,0)	Invitrogen	AM9260G
Água de grau PCR			Qualquer água certificada de grau PCR pode ser usada
Proteinase K 20 mg/mL	Thermo Fisher Científico	AM2546
materiais
Placa de 96 poços ddPCR	Bio-Rad	12001925
Cartucho e gaxetas do gerador DG8 da gota	Bio-Rad	1864007
Óleo de geração de gotículas para sondas	Bio-Rad	1863005
Sondas fluorescentes (por exemplo, sondas FAM/HEX)	Sigma-Aldrich	N/A	As sondas são específicas para experimentos e podem ser adquiridas de qualquer vendedor certificado disponível.
Primers de oligonucleotídeos diretos e reversos	Sigma-Aldrich	N/A	Os primers são específicos para experimentos e podem ser adquiridos de qualquer vendedor certificado disponível.
equipamento
Termociclador C1000 Touch	Bio-Rad	1851148	Pode usar outro termociclador com função de gradiente e poço profundo