Reação em cadeia da polimerase gradiente para determinar a temperatura ideal de recozimento

Resumo

Fonte: Tsujimoto, H. et al., Detecção de Indel após mutagênese CRISPR/Cas9 usando análise de derretimento de alta resolução no mosquito Aedes aegypti. J. Vis. Exp. (2021).

Este vídeo demonstra a reação em cadeia da polimerase gradiente para otimização da temperatura de recozimento dos primers, que define a temperatura de recozimento gradiente ao longo dos poços. O efeito de diferentes temperaturas de recozimento é determinado pelo rendimento de produtos amplificados que ajudam a otimizar a condição de reação.

Protocolo

1. Varredura de polimorfismos de nucleotídeo único (SNPs), design de primer HRMA e validação de primer

1. Identificação de SNP em mosquitos de colônia de laboratório do tipo selvagem
   1. Selecione o éxon alvo para interromper a tradução adequada do polipeptídeo.
      nota: O alvo deve estar próximo do códon de início ou entre os principais resíduos necessários para a função da proteína. Quanto mais curto o éxon (por exemplo, ≤200 bases), mais difícil é direcioná-lo e analisá-lo. Evite editar perto dos limites de um éxon, pois isso força um dos primers HRMA a cruzar um íntron ou estar em um íntron. Isso é indesejável porque as taxas de SNP tendem a ser muito maiores nessas regiões.
   2. Design de primer
      1. Acesse o site do NCBI Blast - Primer Blast, copie e cole o exon escolhido na caixa na parte superior da página | escolha o tamanho do produto PCR (certifique-se de que abrange a maior parte do exon) | escolha o organismo.
      2. Clique em Parâmetros avançados | Opte (para PCR Product Tm) e adicione 60 (para uma temperatura ideal de 60 °C) | Obtenha primers. Mantenha os outros parâmetros como padrão.
   3. Obtenha DNA genômico (gDNA) da colônia de laboratório do tipo selvagem. Separe 10 mosquitos, anestesieste-os com CO₂ e coloque-os em uma placa de Petri no gelo para mantê-los inativos. Configure 10 tubos contendo 0,5 μL do reagente para a liberação de DNA do tecido e 20 μL de tampão de diluição, ambos fornecidos no kit de liberação de DNA sugerido na Tabela de Materiais.
   4. Remova uma perna de um único mosquito usando uma pinça e coloque-a em um tubo correspondente de uma solução diluída do reagente de liberação de DNA (da etapa 1.1.3), submergindo completamente a perna na solução. Repita esta etapa com os mosquitos restantes, limpando a pinça com etanol 70% antes de prosseguir para a próxima.
   5. Incube a solução contendo perna em temperatura ambiente por 2-5 min, depois a 98 ° C por 2 min e deixe-a esfriar enquanto configura a reação de PCR.
      nota: As placas contendo o gDNA liberado podem ser armazenadas a -20 ° C, e o protocolo pode ser pausado neste ponto.
   6. Prepare 10 tubos contendo 10 μL de 2x PCR Master Mix, primers para uma concentração final de 0,5 μM e água de grau molecular para um volume final de 20 μL e transfira 1 μL da amostra diluída para cada tubo. Realizar PCR seguindo estes parâmetros de ciclagem: 98 °C 5 min, 40 ciclos de 98 °C durante 5 s, 60 °C 30 s, 72 °C 20 s por kb; extensão final de 72 °C por 1 min.
   7. Purifique os produtos de PCR com uma enzima para degradar os primers de PCR residuais e desfosforilar o excesso de dNTPs ou qualquer kit de limpeza de coluna. Prossiga com o sequenciamento das amostras.
   8. Analise cada eletroferograma quanto à presença de picos duplos/bases ambíguas e ajuste as chamadas de base manualmente em cada sequência usando o código base degenerado apropriado.
      nota: Esta etapa deve ser executada antes do alinhamento de múltiplas sequências, pois é comum que o software de chamada de base selecione o pico mais proeminente como a chamada de base "verdadeira", dando a falsa impressão de ausência de SNPs.
   9. Execute um alinhamento de sequência múltipla usando o software de alinhamento, SeqMan Pro, listado na Tabela de Materiais ou outro software de alinhamento de código aberto, como ClustalW ou T-Coffe.
      1. Abra o software de alinhamento | clique em Adicionar sequências | selecione as sequências desejadas e clique em Adicionar | Depois que todas as sequências forem escolhidas, clique em Concluído.
      2. Clique em Montar para realizar o alinhamento. Para abrir o alinhamento, clique em Contig 1 e analise o alinhamento e identifique os SNPs (Figura 1).
         nota: Como alternativa às etapas 1.1.3-1.1.6, a PCR pode ser realizada a partir de DNA genômico isolado obtido de amostras em massa (derivado de >10 indivíduos). Amplicons sequenciados podem ser analisados diretamente quanto à presença de SNPs aparecendo como picos duplos no eletroferograma, embora SNPs raros sejam mais difíceis de detectar.
   10. Projete 3-5 RNAs de guia único (sgRNAs), evitando regiões contendo qualquer SNP identificado acima, seguindo o protocolo descrito em.

2. Projeto de primer HRMA

1. Teste a sequência de éxons para a possível formação de estruturas secundárias durante a PCR usando mFold.
   1. Vá para o Servidor Web UNAFold | clique em mFold | no menu suspenso, clique em Aplicativos | Forma de dobramento de DNA.
   2. Digite o nome da sequência na caixa e cole o éxon.
   3. Altere a temperatura de dobramento para 60 °C; nas condições iônicas, altere [Mg⁺⁺] para 1,5 e, em Unidades, mude para mM; clique em Fold DNA.
   4. Em Saída, abaixo de Estrutura 1, clique em pdf para abrir os Gráficos de Estrutura Circular.
2. Acesse NCBI Blast - Primer Blast para design de primer.
3. Copie e cole a sequência de éxons selecionada determinada pelo sequenciamento na etapa 1.1 (a sequência que contém o menor número de SNPs ou nenhum SNPs) na caixa na parte superior da página.
4. Use o símbolo < > para marcar e excluir sequências que contenham SNPs, o local de destino e regiões com possível formação de estrutura secundária.
5. Selecione o tamanho do produto de PCR entre 80 e 150 pb e escolha o organismo.
   nota: Tamanhos de fragmentos maiores podem ser usados com sucesso (~ 300 bp). No entanto, amplicons mais longos podem diminuir a sensibilidade entre sequências que diferem em um ou apenas alguns pares de bases.
6. Clique em Obter Primers. Selecione 2 a 3 pares de primers a serem testados (idealmente, os locais dos primers estão a ≥20 a 50 pb de distância de qualquer local alvo do CRISPR).

3. Validação do primer

1. Realize uma PCR de gradiente usando gDNA de um único indivíduo.
   1. Prepare uma mistura principal e remova uma amostra para o controle sem modelo (NTC) em um tubo separado. Adicione o modelo à mistura principal restante e alíquota em uma placa de 96 poços.
   2. Siga os parâmetros de ciclagem: 98 °C 30 s, 34 ciclos de 98 °C por 10 s, 55–65 °C 30 s, 72 °C 15 s; extensão final de 72 °C por 10 min.
   3. Gere perfis de fusão térmica seguindo os parâmetros: etapa de desnaturação 95 °C por 1 min, recozimento de 60 °C por 1 min, detecção da curva de fusão entre 75 °C e 95 °C em incrementos de 0,2 °C, com tempo de espera de 10 s em cada temperatura.
      nota: Somente temperaturas de recozimento com um único perfil de fusão térmica devem ser usadas.

Resultados

Figura 1: Identificação do SNP. Representação esquemática do alinhamento de sequência múltipla do fragmento AaeZIP11 do tipo selvagem. Em vermelho estão os SNPs e em verde estão os fragmentos livres de SNPs; esta região livre de SNP é sugerida para o design de sgRNA e primer. Abreviaturas: SNP = polimorfismo de nucleotídeo único; sgRNA = RNA guia único; LVP = cepa Liverpool.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
70% de etanol			Solução de etanol a 70% em água
Placas de PCR de 96 poços e PCR em tempo real	VWR	82006-636	Para obter DNA genômico (da perna do mosquito)
Modelos de placas de 96 poços			Impresso em casa, para registro de genótipos
Bio Rad CFX96	Bio Rad		Máquina de PCR com recursos de gradiente e HRMA
Reservatórios de reagentes biotecnológicos diversificados	VWR	Rolamento 490006-896
Kit de limpeza de PCR rápido Exo-CIP	Biolabs da Nova Inglaterra	E1050S
Placa de Petri de vidro	VWR	89001-246	150 mm x 20 mm
Fita de vedação de acrilato de poliolefina Nunc, Thermo Scientific	VWR	Rolamento 37000-548	Para usar com as placas de PCR de 96 poços para obter DNA genômico
Kit de PCR direto de tecido animal de Pelhia (sem ferramentas de amostragem)	Thermo Fisher	F140WH	Para obtenção de DNA genômico e realização de PCR
Software de análise de fusão de precisão	Bio Rad	1845025	Usado para genotipagem das amostras de DNA do mosquito e análise das propriedades de desnaturação térmica do DNA de fita dupla (consulte a etapa 3.3 do protocolo)
Pipetador de canal único	Gilson
Kit de PCR direto de tecido animal de Pelhia (sem ferramentas de amostragem)	Thermo Fisher	F140WH	Para obtenção de DNA genômico e realização de PCR
SeqMan Pro	Software DNAstar Lasergene		Para alinhamento de várias sequências
Pipetador de canal único	Gilson