PCR digital duplex para quantificação simultânea de marcadores genéticos duplos

Resumo

Fonte: Cao, Y., et al. Um ensaio de PCR digital duplex para quantificação simultânea do Enterococcus spp. e o marcador HF183 associado a fezes humanos em águas. J. Vis. Exp. (2016)

Neste vídeo, demonstramos a técnica de PCR digital duplex (ddPCR) - uma modificação da técnica tradicional de PCR que é útil na detecção de dois marcadores genéticos diferentes simultaneamente. Uma única reação de PCR é particionada em gotículas emulsionadas do tamanho de nanolitros que são amplificadas independentemente, e a detecção de sinais de amplificação de fluorescência de cores diferentes da fração de gotículas é usada para calcular a concentração inicial das sequências alvo.

Protocolo

1. Preparação da mistura de ensaio

1. Fazer concentrações de estoque de 100 μmol/L para todos os primers em água de grau molecular e sondas em tampão TE pH 8 [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ; HF183-1, BthetR1, BthetP].
   NOTA: As sondas para os dois alvos são marcadas com fluorescência com fluoróforos diferentes, conforme indicado na Lista de Materiais/Equipamentos.
2. Prepare a mistura principal misturando, por reação planejada, uma mistura de PCR digital de 12 μl (2x estoque, consulte a Lista de Materiais/Equipamentos), 0,216 μl cada primer direto e reverso, 0,06 μl cada sonda fluorescente e 5,0....

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microtubos de baixa ligação	Costar	3207	Para armazenamento de reagentes, amostras/produção de master mixes
Água Livre de Nuclease	FisherSci	BP2484-50
Tampão TE pH 8	FisherSci	BP2473-100
Placa rígida de 96 poços	BioRad	HSP-9601	Para mistura mestre inicial e inoculação de amostras
Filme de vedação de alumínio	BioRad	Rolamento 359-0133	Para selar a placa de amostra
Gerador de gotículas	BioRad	186-3002
Óleo de geração de gotículas	BioRad	186-3005
cartucho	BioRad	186-4008
Suporte de cartucho DG8	BioRad	186-3051
gaxeta	BioRad	186-3009
Ponteiras de pipeta de 20 litros	Rainin	GP-L10F	Para tansferring sample/master mix para cartidge
Ponteiras de pipeta de 200 litros	Rainin	GP-L200F	Para transferir gotículas para a placa final Twin.Tec
Placa de 96 poços Twin.Tec	Eppendorf	951020320	Para gotículas finais, ciclos térmicos e leitura
Folha de selagem térmica perfurável	BioRad	Rolamento 181-4040	Para selar a placa Twin.Tec antes do ciclo térmico
Seladora de placas PCR PX1	BioRad	181-4000	Apenas o termociclador é necessário, sem óptica
Termociclador CFX96	BioRad	CFX96 e C1000
Leitor de gotículas QX100	BioRad	186-3001
Óleo de leitor de gotículas	BioRad	186-3004
PCR de gotículas Supermix	BioRad	186-3024	ou seja, a mistura de PCR digital no manuscrito
Software QuantaSoft (v1.3.2)	Quantasoft	QX100	Para visualizar, analisar e exportar dados ddPCR
Entero Forward Primer (Ent F1A)	Operon	GAGAAATTCCAAACGAACTTG	Fornecedor alternativo pode ser usado
Primer Reverso Entero (Ent R1)	Operon	CAGTGCTCTACCTCCATCATT	Fornecedor alternativo pode ser usado
Sonda Entero (GPL813TQ)	Operon	[6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1]	Um fornecedor alternativo pode ser usado, mas o fluoróforo deve ser FAM
Primer dianteiro HF183 (HF183-1)	Operon	ATCATGAGTTCACATGTCCG	Fornecedor alternativo pode ser usado
Primer reverso HF183 (BthetR1)	Operon	CGTAGGAGTTTGGACCGTGT	Fornecedor alternativo pode ser usado
Sonda HF183 (BthetP1)	Operon	[6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1]	Um fornecedor alternativo pode ser usado, mas o fluoróforo deve ser HEX (se estiver usando VIC, a compensação matricial apropriada deve ser escolhida).
Controle positivo			Mistura de DNA genômico de E.faecalis e plasmídeo padrão HF183 (encomendado ao IDT). Para métodos detalhados de cultura de E. faecalis e sequências do plasmídeo HF183 ordenado, consulte Cao et al. 2015 (doi: 10.1016 / j.watres.2014.12.008). Os padrões de DNA de Enterococcus disponíveis comercialmente (ATCC 29212Q-FZ) também podem ser usados no controle positivo no lugar do DNA genômico de E. faecalis preparado em laboratório.