PCR digital duplex para quantificação simultânea de marcadores genéticos duplos

Abstract

Fonte: Cao, Y., et al. Um ensaio de PCR digital duplex para quantificação simultânea do Enterococcus spp. e o marcador HF183 associado a fezes humanos em águas. J. Vis. Exp. (2016)

Neste vídeo, demonstramos a técnica de PCR digital duplex (ddPCR) - uma modificação da técnica tradicional de PCR que é útil na detecção de dois marcadores genéticos diferentes simultaneamente. Uma única reação de PCR é particionada em gotículas emulsionadas do tamanho de nanolitros que são amplificadas independentemente, e a detecção de sinais de amplificação de fluorescência de cores diferentes da fração de gotículas é usada para calcular a concentração inicial das sequências alvo.

Protocol

1. Preparação da mistura de ensaio

1. Fazer concentrações de estoque de 100 μmol/L para todos os primers em água de grau molecular e sondas em tampão TE pH 8 [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ; HF183-1, BthetR1, BthetP].
   NOTA: As sondas para os dois alvos são marcadas com fluorescência com fluoróforos diferentes, conforme indicado na Lista de Materiais/Equipamentos.
2. Prepare a mistura principal misturando, por reação planejada, uma mistura de PCR digital de 12 μl (2x estoque, consulte a Lista de Materiais/Equipamentos), 0,216 μl cada primer direto e reverso, 0,06 μl cada sonda fluorescente e 5,016 μl de água livre de nuclease (concentração final: 900 nM cada primer, 250 nM cada sonda). Pipete para cima e para baixo pelo menos 10 vezes para misturar, tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar na solução.
3. Pipetar 18 μl de master mix (do passo 1.2) para um tubo ou placa de PCR regular, misturando em 6 μl de molde de ADN (extraído conforme descrito anteriormente) para fazer uma mistura de ensaio para a produção de gotículas. Se estiver executando amostras em duplicata, pipete 36 μl de master mix e 12 μl de molde de DNA em cada poço. Deixar os alvéolos de replicação correspondentes vazios na placa. Inclua controles positivos (consulte Lista de Materiais/Equipamentos) e nenhum controle de modelo (NTC) (ou seja, com água de grau molecular usada como modelo).
   nota: O controle positivo é necessário para garantir que o ensaio esteja funcionando corretamente e o NTC é necessário para garantir que não haja contaminação dentro da placa e para definir a linha de base fluorescente posteriormente na análise dos dados. Recomenda-se que os usuários iniciantes usem amostras de DNA não diluídas e diluídas.

2. Geração de gotículas e configuração da placa de PCR

1. Misture as misturas de ensaio pipetando para cima e para baixo aproximadamente 15 vezes usando uma pipeta multicanal. Certifique-se de que a ponta da pipeta permaneça dentro do líquido para evitar bolhas excessivas na mistura.
2. Insira o cartucho 1 (contendo 8 poços) em um porta-cartucho branco e feche o porta-cartucho. O cartucho 1 agora está firmemente no lugar e não pode ser desalojado do suporte durante a geração de gotículas. Usando uma pipeta multicanal, transfira suavemente 20 μl da mistura de ensaio para a posição central do cartucho marcado como 'Amostra' sem introduzir bolhas de ar.
3. Pipetar 70 μl de óleo de geração de gotículas para o lado esquerdo do cartucho (marcado com «Óleo»).
4. Cubra o cartucho com uma junta, certificando-se de que a junta esteja plana e mantida uniformemente pelos 4 tiques em direção à borda do cartucho. Pressione o botão verde aceso no gerador de gotículas para abrir e colocar o cartucho. Pressione o botão verde novamente para fechar o gerador.
   nota: Assim que a porta se fecha, o botão é escurecido, a porta não pode ser reaberta e a geração de gotículas começa imediatamente por aproximadamente 1 min.
5. Se estiver fazendo mais de 8 reações, coloque o cartucho 2 em um segundo suporte de cartucho branco e prepare da mesma maneira que o cartucho 1 enquanto a geração de gotículas estiver em andamento para economizar tempo total de configuração.
6. Abra a porta do gerador de gotículas quando o botão mal iluminado ficar verde, indicando a conclusão da geração de gotículas. Remova o suporte do cartucho branco que contém o cartucho 1, coloque-o de lado e coloque o cartucho 2 no gerador de gotículas.
7. Remova a junta do cartucho 1 e descarte. Transfira suavemente o volume total (aproximadamente 40 μl) de gotículas geradas da terceira coluna do cartucho (marcada como 'Gotículas') para uma placa PCR final (mantida em temperatura ambiente) para ciclagem térmica.
   nota: Não desclique o suporte do cartucho branco, pois a ação pode quebrar as gotículas recém-geradas; Abra o suporte do cartucho somente depois que as gotículas forem transferidas para a placa final.
8. Repita as etapas 2.1-2.7 para amostras adicionais.
9. Quando todas as gotículas estiverem na placa PCR final, coloque uma tampa de alumínio perfurável em cima da placa e coloque-a em um selador de placas. Ajuste o selador para 180 °C, pressione 'Play' no selador e deixe selar por 10 segundos.

3. Ciclagem térmica e leitura de gotículas

1. Coloque a placa selada no termociclador, compatível com a placa PCR final usada na etapa 2.7, e uma velocidade de rampa de temperatura de 2.0 °C/seg.
2. Execute o programa térmico da seguinte forma: 10 min a 95 °C, seguido por 40 ciclos de 30 segundos a 94 °C e 60 segundos a 60 °C, seguido por uma espera de 10 min a 98 °C (opcional: retenção final a 4 ou 15 °C).
3. Após a conclusão do ciclo, transfira a placa para um leitor de gotículas para medição automática de fluorescência em cada gota em cada poço. Em alternativa, conservar a placa a 4 °C até 3 dias antes da leitura das gotas. Certifique-se de que as gotículas estejam em temperatura ambiente antes de prosseguir com a leitura.
   1. Abra o software que acompanha para configurar a leitura de gotículas. No menu padrão 'Configuração' contendo um esquema de uma placa vazia de 96 poços, clique duas vezes no poço A1 para abrir o menu contendo três seções: 'Amostra', 'Ensaio 1' e 'Ensaio 2'.
   2. Na seção 'Amostra', digite o ID da amostra na caixa 'Nome' e pressione Enter ou marque a caixa à direita marcada como 'Aplicar'. Em seguida, clique no menu suspenso 'Experimento' e escolha 'RED' (detecção de eventos raros) e clique em Enter.
   3. Vá para a seção indicada 'Ensaio 1'. Na seção 'Nome', preencha o ensaio (por exemplo, Enterococcus) e clique em enter. Na caixa abaixo rotulada como 'Tipo', clique no menu suspenso e escolha 'Canal 1 Desconhecido' e clique em Enter.
   4. Vá para a seção denotada 'Ensaio 2'. Na seção 'Nome', preencha o ensaio (por exemplo, HF183) e clique em enter. Na caixa abaixo denominada 'Tipo', clique no menu suspenso e escolha 'Canal 2 Desconhecido' e clique em Enter. Todas as informações das etapas 3.3.2 a 3.3.4 agora estão presentes no poço A1.
   5. Nomeie todos os poços subsequentes contendo gotículas. Para economizar o tempo total de configuração, clique em 'Shift' ou 'Ctrl' para escolher vários poços simultaneamente.
   6. Quando a representação digital da placa espelhar a placa física, pressione 'OK' no canto inferior direito do menu. No novo menu que aparece na parte superior do esquema da placa, na seção 'Modelo', escolha 'Salvar como' e nomeie e salve a placa.
   7. À esquerda da tela, clique em 'Executar' e selecione o conjunto de tintura apropriado na janela pop-out "Opções de execução". A coleta de dados é iniciada e exibida em tempo real no software.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microtubos de baixa ligação	Costar	3207	Para armazenamento de reagentes, amostras/produção de master mixes
Água Livre de Nuclease	FisherSci	BP2484-50
Tampão TE pH 8	FisherSci	BP2473-100
Placa rígida de 96 poços	BioRad	HSP-9601	Para mistura mestre inicial e inoculação de amostras
Filme de vedação de alumínio	BioRad	Rolamento 359-0133	Para selar a placa de amostra
Gerador de gotículas	BioRad	186-3002
Óleo de geração de gotículas	BioRad	186-3005
cartucho	BioRad	186-4008
Suporte de cartucho DG8	BioRad	186-3051
gaxeta	BioRad	186-3009
Ponteiras de pipeta de 20 litros	Rainin	GP-L10F	Para tansferring sample/master mix para cartidge
Ponteiras de pipeta de 200 litros	Rainin	GP-L200F	Para transferir gotículas para a placa final Twin.Tec
Placa de 96 poços Twin.Tec	Eppendorf	951020320	Para gotículas finais, ciclos térmicos e leitura
Folha de selagem térmica perfurável	BioRad	Rolamento 181-4040	Para selar a placa Twin.Tec antes do ciclo térmico
Seladora de placas PCR PX1	BioRad	181-4000	Apenas o termociclador é necessário, sem óptica
Termociclador CFX96	BioRad	CFX96 e C1000
Leitor de gotículas QX100	BioRad	186-3001
Óleo de leitor de gotículas	BioRad	186-3004
PCR de gotículas Supermix	BioRad	186-3024	ou seja, a mistura de PCR digital no manuscrito
Software QuantaSoft (v1.3.2)	Quantasoft	QX100	Para visualizar, analisar e exportar dados ddPCR
Entero Forward Primer (Ent F1A)	Operon	GAGAAATTCCAAACGAACTTG	Fornecedor alternativo pode ser usado
Primer Reverso Entero (Ent R1)	Operon	CAGTGCTCTACCTCCATCATT	Fornecedor alternativo pode ser usado
Sonda Entero (GPL813TQ)	Operon	[6-FAM]-TGG TTC TCT CCG AAA TAG CTT TAG GGC TA-[BHQ1]	Um fornecedor alternativo pode ser usado, mas o fluoróforo deve ser FAM
Primer dianteiro HF183 (HF183-1)	Operon	ATCATGAGTTCACATGTCCG	Fornecedor alternativo pode ser usado
Primer reverso HF183 (BthetR1)	Operon	CGTAGGAGTTTGGACCGTGT	Fornecedor alternativo pode ser usado
Sonda HF183 (BthetP1)	Operon	[6-HEX]-CTGAGAGGAAGGTCCCCC ACATTGGA-[BHQ1]	Um fornecedor alternativo pode ser usado, mas o fluoróforo deve ser HEX (se estiver usando VIC, a compensação matricial apropriada deve ser escolhida).
Controle positivo			Mistura de DNA genômico de E.faecalis e plasmídeo padrão HF183 (encomendado ao IDT). Para métodos detalhados de cultura de E. faecalis e sequências do plasmídeo HF183 ordenado, consulte Cao et al. 2015 (doi: 10.1016 / j.watres.2014.12.008). Os padrões de DNA de Enterococcus disponíveis comercialmente (ATCC 29212Q-FZ) também podem ser usados no controle positivo no lugar do DNA genômico de E. faecalis preparado em laboratório.