1. Preparação da mistura de ensaio
- Fazer concentrações de estoque de 100 μmol/L para todos os primers em água de grau molecular e sondas em tampão TE pH 8 [Entero F1A, Entero R1, GPL813TQ; HF183-1, BthetR1, BthetP].
NOTA: As sondas para os dois alvos são marcadas com fluorescência com fluoróforos diferentes, conforme indicado na Lista de Materiais/Equipamentos.
- Prepare a mistura principal misturando, por reação planejada, uma mistura de PCR digital de 12 μl (2x estoque, consulte a Lista de Materiais/Equipamentos), 0,216 μl cada primer direto e reverso, 0,06 μl cada sonda fluorescente e 5,016 μl de água livre de nuclease (concentração final: 900 nM cada primer, 250 nM cada sonda). Pipete para cima e para baixo pelo menos 10 vezes para misturar, tomando cuidado para não introduzir bolhas de ar na solução.
- Pipetar 18 μl de master mix (do passo 1.2) para um tubo ou placa de PCR regular, misturando em 6 μl de molde de ADN (extraído conforme descrito anteriormente) para fazer uma mistura de ensaio para a produção de gotículas. Se estiver executando amostras em duplicata, pipete 36 μl de master mix e 12 μl de molde de DNA em cada poço. Deixar os alvéolos de replicação correspondentes vazios na placa. Inclua controles positivos (consulte Lista de Materiais/Equipamentos) e nenhum controle de modelo (NTC) (ou seja, com água de grau molecular usada como modelo).
nota: O controle positivo é necessário para garantir que o ensaio esteja funcionando corretamente e o NTC é necessário para garantir que não haja contaminação dentro da placa e para definir a linha de base fluorescente posteriormente na análise dos dados. Recomenda-se que os usuários iniciantes usem amostras de DNA não diluídas e diluídas.
2. Geração de gotículas e configuração da placa de PCR
- Misture as misturas de ensaio pipetando para cima e para baixo aproximadamente 15 vezes usando uma pipeta multicanal. Certifique-se de que a ponta da pipeta permaneça dentro do líquido para evitar bolhas excessivas na mistura.
- Insira o cartucho 1 (contendo 8 poços) em um porta-cartucho branco e feche o porta-cartucho. O cartucho 1 agora está firmemente no lugar e não pode ser desalojado do suporte durante a geração de gotículas. Usando uma pipeta multicanal, transfira suavemente 20 μl da mistura de ensaio para a posição central do cartucho marcado como 'Amostra' sem introduzir bolhas de ar.
- Pipetar 70 μl de óleo de geração de gotículas para o lado esquerdo do cartucho (marcado com «Óleo»).
- Cubra o cartucho com uma junta, certificando-se de que a junta esteja plana e mantida uniformemente pelos 4 tiques em direção à borda do cartucho. Pressione o botão verde aceso no gerador de gotículas para abrir e colocar o cartucho. Pressione o botão verde novamente para fechar o gerador.
nota: Assim que a porta se fecha, o botão é escurecido, a porta não pode ser reaberta e a geração de gotículas começa imediatamente por aproximadamente 1 min.
- Se estiver fazendo mais de 8 reações, coloque o cartucho 2 em um segundo suporte de cartucho branco e prepare da mesma maneira que o cartucho 1 enquanto a geração de gotículas estiver em andamento para economizar tempo total de configuração.
- Abra a porta do gerador de gotículas quando o botão mal iluminado ficar verde, indicando a conclusão da geração de gotículas. Remova o suporte do cartucho branco que contém o cartucho 1, coloque-o de lado e coloque o cartucho 2 no gerador de gotículas.
- Remova a junta do cartucho 1 e descarte. Transfira suavemente o volume total (aproximadamente 40 μl) de gotículas geradas da terceira coluna do cartucho (marcada como 'Gotículas') para uma placa PCR final (mantida em temperatura ambiente) para ciclagem térmica.
nota: Não desclique o suporte do cartucho branco, pois a ação pode quebrar as gotículas recém-geradas; Abra o suporte do cartucho somente depois que as gotículas forem transferidas para a placa final.
- Repita as etapas 2.1-2.7 para amostras adicionais.
- Quando todas as gotículas estiverem na placa PCR final, coloque uma tampa de alumínio perfurável em cima da placa e coloque-a em um selador de placas. Ajuste o selador para 180 °C, pressione 'Play' no selador e deixe selar por 10 segundos.
3. Ciclagem térmica e leitura de gotículas
- Coloque a placa selada no termociclador, compatível com a placa PCR final usada na etapa 2.7, e uma velocidade de rampa de temperatura de 2.0 °C/seg.
- Execute o programa térmico da seguinte forma: 10 min a 95 °C, seguido por 40 ciclos de 30 segundos a 94 °C e 60 segundos a 60 °C, seguido por uma espera de 10 min a 98 °C (opcional: retenção final a 4 ou 15 °C).
- Após a conclusão do ciclo, transfira a placa para um leitor de gotículas para medição automática de fluorescência em cada gota em cada poço. Em alternativa, conservar a placa a 4 °C até 3 dias antes da leitura das gotas. Certifique-se de que as gotículas estejam em temperatura ambiente antes de prosseguir com a leitura.
- Abra o software que acompanha para configurar a leitura de gotículas. No menu padrão 'Configuração' contendo um esquema de uma placa vazia de 96 poços, clique duas vezes no poço A1 para abrir o menu contendo três seções: 'Amostra', 'Ensaio 1' e 'Ensaio 2'.
- Na seção 'Amostra', digite o ID da amostra na caixa 'Nome' e pressione Enter ou marque a caixa à direita marcada como 'Aplicar'. Em seguida, clique no menu suspenso 'Experimento' e escolha 'RED' (detecção de eventos raros) e clique em Enter.
- Vá para a seção indicada 'Ensaio 1'. Na seção 'Nome', preencha o ensaio (por exemplo, Enterococcus) e clique em enter. Na caixa abaixo rotulada como 'Tipo', clique no menu suspenso e escolha 'Canal 1 Desconhecido' e clique em Enter.
- Vá para a seção denotada 'Ensaio 2'. Na seção 'Nome', preencha o ensaio (por exemplo, HF183) e clique em enter. Na caixa abaixo denominada 'Tipo', clique no menu suspenso e escolha 'Canal 2 Desconhecido' e clique em Enter. Todas as informações das etapas 3.3.2 a 3.3.4 agora estão presentes no poço A1.
- Nomeie todos os poços subsequentes contendo gotículas. Para economizar o tempo total de configuração, clique em 'Shift' ou 'Ctrl' para escolher vários poços simultaneamente.
- Quando a representação digital da placa espelhar a placa física, pressione 'OK' no canto inferior direito do menu. No novo menu que aparece na parte superior do esquema da placa, na seção 'Modelo', escolha 'Salvar como' e nomeie e salve a placa.
- À esquerda da tela, clique em 'Executar' e selecione o conjunto de tintura apropriado na janela pop-out "Opções de execução". A coleta de dados é iniciada e exibida em tempo real no software.
