1. Quantificação de RNA usando um espectrofotômetro de microvolume
- Certifique-se de que as configurações do espectrofotômetro estejam definidas para RNA.
- Use 1-2 μL de água de grau molecular para inicializar a máquina e definir uma linha de base.
- Use 1-2 μL de cada amostra de RNA de teste para avaliar a quantidade de RNA.
- Salve as leituras e o documento.
- Ajuste o RNA para 1 μg/μL, se necessário.
nota: O RNA deve ser mantido no gelo (ou em um bloco frio) o tempo todo. Se o RNA for obtido usando uma coluna ou método baseado em esferas, o RNA geralmente é inferior a 1 μg/μL. Nesta situação, use o RNA puro.
2. Preparação da série de diluição de RNA para determinar a sensibilidade do ponto final
- Faça uma diluição serial de 10 vezes do RNA.
- Rotule os tubos com a série de diluição (por exemplo, 10-1, 10-2, etc.) e os detalhes do RNA.
- Adicione 45 μL de água de grau molecular a cada tubo.
- Adicione 5 μL do RNA (previamente diluído a 1 μg/μL) e misture bem.
- Descarte a ponta da pipeta no desinfetante apropriado e substitua-a por uma nova ponteira.
- Pegue 5 μL do tubo 10-1 e adicione ao tubo 10-2 e misture bem.
- Repita 2.1.3-2.1.5 com as diluições restantes.
NOTA: O RNA deve ser mantido no gelo (ou em um bloco frio) o tempo todo.
3. Preparação de reações de RT-PCR em tempo real
- Usando uma planilha, planeje o layout da placa de acordo com o número de amostras de teste e amostras de controle, tanto para os ensaios de lissavírus quanto para ß-actina.
nota: Se 4 amostras forem testadas em duplicado com controle positivo e negativo, isso equivale a 10 reações para ambos os ensaios.
- Em uma 'sala limpa' ou área separada do modelo de RNA, limpe as superfícies com um desinfetante apropriado antes de usar ou prepare uma estação de trabalho de PCR (se estiver usando). Para preparar a estação de trabalho, limpe a superfície do gabinete com um desinfetante apropriado e coloque os itens necessários na estação de trabalho e feche as portas. Ligue a luz UV por 10 minutos.
- Retire os regentes e primers do freezer e descongele (reagentes listados na Tabela 1 e primers na Tabela 2).
NOTA: A mistura enzimática é armazenada em glicerol, portanto, não requer descongelamento e deve ser mantida no gelo (ou em um bloco frio) o tempo todo. Todos os outros reagentes podem ser descongelados à temperatura ambiente.
- Depois de descongelado, misture os reagentes e centrifugue brevemente para coletar o líquido.
NOTA: Não vórtice a mistura de enzimas, apenas centrifugue brevemente.
- Preparar misturas principais separadas para o lyssavirus e a ß-actina. Para cada reação, adicione 7,55 μL de água de grau molecular, 10 μL de mistura de reação verde 2x Universal SYBR, 0,6 μL de primer direto, 0,6 μL de primer reverso, 0,25 μL de mistura enzimática iTaq RT.
- Use uma planilha para calcular os volumes corretos para evitar erros no cálculo manual. Certifique-se de que o master-mix esteja preparado para compensar os erros de pipetagem. Portanto, se forem necessárias 10 reações (ver NOTA em 3.1), prepare 12 reações
- Prepare a master-mix no gelo (ou em um bloco frio) e permaneça no gelo até ser colocada na máquina em tempo real.
- Misture as master-mixes preparadas, centrifugue brevemente e dispense 19 μL nos poços relevantes de tubos de tira ou em uma placa de 96 poços compatível com a máquina de tempo real em uso.
NOTA: Minimize a produção de bolhas nos poços durante a pipetagem.
- Em uma sala separada ou em um gabinete de UV preparado conforme descrito em 3.2, adicione cuidadosamente 1 μL do RNA previamente ajustado a 1 μg / μL (consulte a etapa 1.5) abaixo da superfície do poço de mistura principal apropriado e misture suavemente. Descarte a ponta da pipeta no desinfetante logo após o uso (sob a superfície).
- Adicione os controles após as amostras de teste, com o controle positivo adicionado a seguir e o controle sem modelo (NTC – água de grau molecular) adicionado por último. A quantidade de RNA usada pode ser alterada dependendo do tipo de amostra e da extração de RNA usada. A quantidade utilizada deve ser validada para garantir que a reação seja otimizada.
- Sele a placa usando tampas de tira ou selador, tomando cuidado para garantir que todas as tampas estejam firmemente fechadas e rotuladas o suficiente para orientar as amostras. Rotule a borda dos tubos de placa/tira.
- Gire as amostras usando uma centrífuga para coletar todo o líquido no fundo dos poços.
- Transfira a placa para a máquina de PCR em tempo real, abra a porta e coloque-a no suporte garantindo a localização/orientação correta das amostras de acordo com o layout da placa.
NOTA: Se forem usadas tiras de tubo, certifique-se de que o suporte esteja no lugar.
- Abra o programa da máquina de PCR em tempo real e escolha a opção de experimento em tempo real SYBR com curva de dissociação. Programe a máquina de PCR em tempo real usando as condições de ciclagem térmica especificadas na Tabela 3, incluindo os pontos de coleta de dados.
- Selecione SYBR como o corante fluorescente e selecione desconhecido como o tipo de amostra e insira um nome na caixa de nome de amostra correta.
nota: Diferenciar entre as réplicas e também entre os poços de lissavírus e ß-actina.
- Escolha um local de arquivo para salvar os dados experimentais, certifique-se de que a lâmpada será desligada no final da execução e, em seguida, inicie a execução.
NOTA: Como a primeira etapa é um estágio RT, nenhum dado é coletado durante esse tempo, portanto, se o lamp requer um período de aquecimento, isso pode ocorrer durante o estágio RT. A máquina e o software em tempo real exibirão as curvas de amplificação em tempo real, enquanto a curva de fusão será gerada no final do ciclo.
