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1. Extração de DNA de tecido FFPE, sangue periférico e aspirado de medula óssea
- Para tecido FFPE de medula óssea com kit de extração de DNA FFPE
- Comece com tecido FFPE de lâminas não coradas (5 a 10 seções com espessura de 5 a 10 μm).
nota: Se começar com aparas de tecido, use 3 a 6 seções com 5 a 10 μm de espessura e pule para a etapa 1.1.6.
- Coloque as lâminas em uma cesta de lâminas e prepare quatro reservatórios de lavagem (dois para xileno e dois para álcool 100%). Adicionar um volume mínimo de 600 ml da solução a cada cesto.
- Desparafinize as lâminas fazendo uma lavagem de xileno de 5 min na primeira bandeja. Transfira as lâminas para o segundo reservatório de lavagem de xileno por mais 5 min.
- Após a desparafinização, lave as lâminas com álcool 100% por 5 min. Transfira as lâminas para o segundo reservatório de lavagem com álcool por mais 5 min.
- Deixe as lâminas secarem completamente sob um capô antes de raspá-las com uma lâmina de barbear em um tubo de microcentrífuga.
nota: Se uma lâmina de H&E com a região do tumor indicada estiver disponível, alinhe as lâminas e raspe apenas a região do tumor.
- Prossiga com as instruções do folheto do fabricante incluído no kit.
- Para aspirado de MO e Sangue Periférico
- Extraia de acordo com o folheto de instruções do fabricante com estas especificações.
nota: Existem vários kits e métodos disponíveis comercialmente para extração de DNA de tecidos e células FFPE. Praticamente, todos podem ser usados. Use um método estabelecido em laboratório.
- Use 200 μL de sangue periférico (PB) ou 100 μL de MO + 100 μL de PBS.
- Use 4 μL de solução estoque de RNase A.
- Eluir com tampão de eluição de 100 μL.
- Quantificação de DNA
- Medir as concentrações de ADN utilizando um espectrofotómetro que assegure uma relação de 260 nm/280 nm de aproximadamente 1,8 (para o ADN puro). Se a proporção for consideravelmente menor, pode indicar a presença de proteínas, fenol ou outros contaminantes que podem interferir nas aplicações a jusante.
- Ajuste as concentrações de DNA para aproximadamente 50 - 100 ng / μL com tampão de eluição apropriado.
2. PCR de bloqueio de tipo selvagem
- Design de primer
- Projetar e obter primers para genes de interesse de acordo com as diretrizes gerais descritas anteriormente do design de primers de PCR. Inclua primers de sequenciamento universal direto e reverso M13 em primers de PCR.
nota: O ensaio MYD88 foi desenvolvido para amplificar o éxon 5 de MYD88 (G259 - N291) e 110 nucleotídeos localizados na região intrônica 5' para cobrir o local de splice e parte do íntron 4. Os primers direto e reverso foram projetados com uma sequência 5'-M13 (M13- forward: tgt aaa acg acg gcc agt; M13-reverso: cag gaa aca gct atg acc) para permitir o recozimento de primers de sequenciamento complementares (consulte a Tabela de Materiais).
- Projeto de oligonucleotídeo de ácido nucleico bloqueado
- Projete o oligonucleotídeo de bloqueio para ter aproximadamente 10 a 15 bases de comprimento e complementar ao molde WT onde o enriquecimento mutante é desejado.
nota: Um oligo mais curto melhorará a discriminação de incompatibilidade. Para obter alta especificidade de alvo, é importante não usar muitos nucleotídeos de bloqueio, pois isso pode resultar em um oligonucleotídeo muito "pegajoso". O conteúdo e o comprimento e o nucleotídeo de bloqueio devem ser otimizados de acordo com o nucleotídeo específico que precisa ser bloqueado. É importante alcançar uma elevada especificidade de ligação sem comprometer a estrutura secundária e arriscar a autocomplementaridade.
- Projete o oligo de bloqueio para ter um Tm 10 - 15 °C acima da temperatura de extensão durante a termociclagem. Ajuste o Tm adicionando ou removendo bases de bloqueio ou substituindo bases de bloqueio por DNA, evitando longos trechos (3 - 4 bases) de bloqueio de bases G ou C.
- Navegue até o site de ferramentas Oligo (consulte Tabela de Materiais) e selecione a ferramenta "blocking Oligo Tm Prediction".
- Cole a sequência do modelo WT que deseja bloquear na caixa "Oligo Sequence". Adicione "+" na frente das bases para indicar as bases bloqueadoras.
- Selecione o botão "Calcular" para determinar o Tm aproximado do híbrido DNA-Blocker.
- Projete o oligo de bloqueio para evitar a formação de estrutura secundária ou autodímeros.
- Navegue até o site das ferramentas Oligo (consulte Tabela de materiais) e selecione a ferramenta "blocking Oligo Optimizer".
- Cole a sequência do modelo WT que deseja bloquear na caixa. Adicione "+" na frente das bases para indicar as bases de bloqueio.
- Selecione as duas caixas para "Estrutura Secundária" e "Somente Próprio". Pressione o botão Analisar para revisar o oligo em busca de estruturas secundárias ou autodímeros potencialmente problemáticos.
nota: As pontuações representam estimativas muito aproximadas dos Tm's das estruturas secundárias e autodímeros. Pontuações mais baixas são, portanto, ideais e podem ser alcançadas limitando o emparelhamento bloqueador-bloqueador. O oligonucleotídeo bloqueador para MYD88 [bloqueador de MYD88 (TCAGA+AG+C+G+A+C+T+G+A+T+CC/invdT/)] foi projetado para cobrir os aminoácidos Q262-I266 e apresenta um dT invertido 3' para inibir ambas as extensões pela DNA polimerase e a degradação pela 3'-exonuclease. Este oligo de bloqueio específico é um 17 mer com 10 bases de bloqueio que são denotadas como "+N". As 7 bases restantes são nucleotídeos de DNA comuns.
- Configuração e termociclagem de WTB-PCR
- Prepare um master mix WTB-PCR (MMX) usando tampão de reação de PCR de 2,5 μL 10x com 20 mM MgCl2, 250 μM dNTPs, 0,2 μM de primer direto e reverso, bloqueador MYD88 de 1,2 μM e DNAse, livre de RNAse, H2O ultrapuro para criar um volume de solução final de 21,75 μL por reação.
nota: As concentrações de trabalho são para o volume final de reação de 25 μL (após a adição do molde de DNA e da polimerase). A PCR MMX convencional é preparada simplesmente omitindo a adição de um bloqueador. Todas as etapas do protocolo permanecem idênticas para WTB e PCR convencional. Isso pode ser usado na validação e determinação do enriquecimento obtido pela adição de um bloqueador.
- Ao calcular a quantidade de MMX a ser preparada, certifique-se de levar em conta 3 reações adicionais (controles positivos e negativos e um controle sem modelo para verificar se há contaminação) e pelo menos 1 reação adicional para erro de pipetagem.
- Vórtice MMX completamente. O MMX pode ser armazenado a -80 °C por até um ano.
- Adicione 0,25 μL de Taq DNA polimerase por reação ao MMX e inverta para misturar. Uma vez que a polimerase tenha sido adicionada ao MMX, mantenha-o no gelo.
- Coloque uma nova placa de PCR de 96 poços em uma placa fria e pipete 22 μL de MMX com a polimerase para cada poço de reação.
- Adicionar 3 μL de ADN genómico (50 - 100 ng/μL a cada um dos alvéolos que contêm a MMX com a polimerase.
- Feche a placa e centrifugue brevemente para garantir que a solução chegue ao fundo de cada poço.
- Carregue a placa PCR em um termociclador.
- Defina as condições de termociclagem para a reação WTB-PCR da seguinte forma: desnaturação inicial a 95 °C por 6 min; 40 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 s, recozimento do primer a 56 °C por 30 s e extensão a 72 °C por 1 min 20 s; extensão final a 72 °C por 10 min.
nota: A prática recomendada envolve completar o restante do protocolo em uma área fisicamente separada para evitar a contaminação do amplicon em configurações futuras.