$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Preparar reações de qPCR
NOTA: Uma reação de PCR é para uma amostra. Cada reação de PCR contém 5 μL de mistura principal de qPCR (ver materiais), 1 μL de mistura de pares de primers de 5 μM, 2 μL de H2O e 2 μL de amostra de fago T7 tratada termicamente. Para múltiplas reações de PCR, todos os reagentes, exceto a amostra de fago, são pré-misturados em um tubo de 1,5 mL. O volume de cada reagente na pré-mistura depende do número de amostras de fagos para qPCR.
- Prepare a pré-mistura de qPCR para 10 amostras de fagos biopanned de concentração desconhecida e 7 amostras de concentrações padrão em triplicata. Como resultado, existem 51 amostras no total e, portanto, 51 reações de qPCR (ou seja, uma reação por amostra). Para 51 reações, prepare uma pré-mistura de 255 μL de master mix de qPCR (51x 5 μL), 51 μL de primers (51x 1 μL) e 102 μL de H2O (51x 2 μL).
nota: Recomenda-se preparar algumas reações de PCR extras para compensar a perda de volume durante a alíquota da mistura de PCR em cada poço da placa de qPCR de 96 poços.
- Alíquota de 8 μL de pré-mistura de PCR em cada poço de placa qPCR de 96 poços para um total de 51 poços (ou seja, 51 reações de qPCR). Não há necessidade de trocar as gorjetas durante a alíquota.
- Adicione 2 μL de amostras de fagos T7 tratadas termicamente ou DNA de referência de fagos T7 a cada poço (Figura 1B); troque as pontas ao adicionar diferentes amostras de DNA ao poço para evitar contaminação cruzada. Além disso, dispense as amostras de DNA de 2 μL sob a superfície da pré-mistura de qPCR (ou seja, na pré-mistura de PCR de 8 μL).
- Sele a placa qPCR com filme adesivo.
nota: Esta etapa é crítica, independentemente do tipo de placa qPCR. Use o kit recomendado para selar completamente a placa; caso contrário, qualquer região não selada na placa causará perda de volume durante o ciclo de PCR.
- Enrole a placa qPCR com papel alumínio para minimizar o fotobranqueamento de fluorescência e prossiga para executá-la no equipamento qPCR.
2. Condições de ciclagem de qPCR
NOTA: as condições de ciclagem de qPCR foram configuradas no equipamento específico de qPCR.
- Execute a placa qPCR de 96 poços no equipamento qPCR. No equipamento, selecione as configurações no menu para configurar as seguintes condições experimentais (Figura 1C).
- Configure as condições de ciclagem da seguinte forma para um sample volume de 10 μL: um ciclo a 50°C por 2 min, um ciclo a 95°C por 2 min, seguido por 40 ciclos de (95°C por 15s, 60°C por 1 min). Depois, execute as configurações da curva de fusão: um ciclo de 95 ° C por 15 s, 60 ° C por 1 min e 95 ° C por 15 s.
- Prossiga para analisar os dados.
