Reação em cadeia da polimerase quantitativa para enumerar bacteriófagos

Neste artigo

Resumo

Fonte: Peng, X., et al., PCR quantitativo do bacteriófago T7 da Biopanning. J. Vis. Exp. (2018)

Neste vídeo, discutimos a reação em cadeia da polimerase quantitativa, qPCR, para enumerar bacteriófagos T7 por meio da quantificação do DNA. O corante fluorescente na mistura de PCR se liga às fitas de DNA recém-sintetizadas e emite fluorescência, que é medida.

Protocolo

1. Preparar reações de qPCR

NOTA: Uma reação de PCR é para uma amostra. Cada reação de PCR contém 5 μL de mistura principal de qPCR (ver materiais), 1 μL de mistura de pares de primers de 5 μM, 2 μL de H₂O e 2 μL de amostra de fago T7 tratada termicamente. Para múltiplas reações de PCR, todos os reagentes, exceto a amostra de fago, são pré-misturados em um tubo de 1,5 mL. O volume de cada reagente na pré-mistura depende do número de amostras de fagos para qPCR.

Prepare a pré-mistura de qPCR para 10 amostras de fagos biopanned de concentração desconhecida e 7 amostras de concentrações padrão em triplic....

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

figure-results-1
Figura 1: Tratamento da amostra de fago, preparação da reação de qPCR e execução de qPCR. As amostras de fagos T7 pré-tratadas com DNase I foram aquecidas a 100 ° C por 15 min para liberar o DNA T7 de partículas de fagos intactas (A); a mistura de qPCR foi preparada conforme descrito no protocolo. Todos os preparativos foram feitos no gelo (A); Equipamentos de qPCR e.......