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1. PCR assimétrico para amplificação de ssDNA
- Preparar uma mistura de reagentes de PCR assimétricos para amplificar o ssDNA a analisar. Descongele os reagentes da Tabela 1 no gelo. Não mantenha a enzima Taq polimerase (50 U/μL) no gelo, mas conserve-a a 20 °C até que seja necessária.
- Agite suavemente todos os reagentes e, em seguida, centrifugue brevemente os tubos a 10.000 x g por 10 s.
- Combine todos os reagentes conforme descrito na Tabela 1.
- Coloque as amostras em um termociclador e inicie a PCR assimétrica nas seguintes condições: 25 ciclos (95 ° C por 30 s, 52 ° C por 30 s e 72 ° C por 30 s), 85 ° C por 5 min, mantenha a 4 ° C.
2. Microsphere-PCR para amplificação de ssDNA
NOTA: Esta seção descreve o protocolo para amplificar o ssDNA em um tubo de reação de PCR. As reações de microesfera-PCR foram realizadas em 50 μL de volume de reação. As sequências detalhadas usadas para amplificar o ssDNA estão listadas na Tabela 2. Nesse caso, o Ap na superfície das microesferas pode recozer para modelos de DNA aleatórios de maneira complementar. Este é um passo muito importante para a produção de fitas de DNA complementares (fita de DNA antisense, Figura 1). O DNA estendido é usado como modelo para amplificação por microesfera-PCR.
- Preparar a mistura de reagentes microesfera-PCR. Descongele os reagentes da Tabela 3 no gelo; no entanto, não mantenha a enzima Taq polimerase no gelo. Armazene-o a -20 °C até que seja necessário.
- Agite suavemente todos os reagentes e, em seguida, centrifugue brevemente os tubos a 10.000 x g por 10 s.
- Obtenha aproximadamente ~25 microesferas através da contagem microscópica.
nota: O número de microesferas em um tubo de reação é calculado usando um microscópio óptico com ampliação de 40X. Cerca de ~ 25 microesferas são usadas para amplificação de microesfera-PCR. Informações mais detalhadas estão na Etapa 3.
- Combine todos os reagentes conforme descrito na Tabela 3.
- Coloque as amostras em um termociclador e inicie a PCR assimétrica nas seguintes condições: 25 ciclos (95 ° C por 30 s, 52 ° C por 30 s e 72 ° C por 30 s), 85 ° C por 5 min, mantenha a 4 ° C.
- Após a amplificação, adicione 8 μL de tampão de carga 6x e carregue 15 μL de cada amostra em gel de agarose a 2%. Em seguida, execute eletroforese a 100 V por 35 min em tampão 1x TAE (Tris-acetato-EDTA, 40 mM Tris-acetato, 1 mM EDTA, pH 8,2).
Tabela 1. Componentes assimétricos da mistura de reagentes de PCR em reação de 20 μL.
| Reagente | Volume para reação 1x (μL) | Concentração final |
| Modelo de DNA aleatório | 1 | 1 ng/μL |
| Primário de avanço de etiqueta | 1 | 0,4 μM |
| Primer reverso | 1 | 0,02 μM |
| 10X tampão Taq | 5 | 1X |
| 10 mM de dNTP | 4 | 2,5 mM |
| Ex taq (1000U) | 0,2 | 1 U |
| Água | 37.8 | - |
| total | 50 | - |
Tabela 2. Informações de sequência para Microsphere-PCR.
| modelo | seqüenciar | Comprimento (nt) |
| Modelo de DNA aleatório | 5'- ATA CCA GCT TAT TCA ATT (Sequência aleatória, 40 mer) AGA TAG TAA GTG CAA TCT-3' | 76 |
| Primer Tag-Forward (Tag-F) | 5'- GGT AAT ACG ACT CAC TAT AGG GAG ATA CCA GCT TAT TCA ATT-3' | 42 |
| Primer reverso | 5'- AGA TTG CAC TTA CTA TCT-3' | 18 |
Tabela 3. Componentes da mistura de reagentes de microesfera-PCR na reação de 50 μL
| Reagente | Volume para reação 1x (μL) | Concentração final |
| Microesferas Ap | ~ 25 microesferas | - |
| Modelo de DNA aleatório | 1 | 1 ng/μL |
| Primer Tag-Forward | 1 | 0,4 μM |
| 10X tampão Taq | 5 | 1X |
| 10 mM dNTP | 4 | 2,5 mM |
| Ex taq (1000U) | 0,2 | 1 U |
| Água | 37.8 | - |
| total | 50 | - |
