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1. Transcrição reversa do RNA viral
- Retire do congelador os reagentes RT enumerados no quadro 1, mantenha-os no gelo, descongele-os e vortexe-os antes da utilização.
- Prepare 12 μL de mistura de reação RT em um tubo de PCR de 0,2 mL com os reagentes listados na Tabela 1. Permitir variações de pipetagem preparando um volume da mistura principal pelo menos um tamanho de reação maior do que o necessário.
- Adicione 8 μL de amostra, RNA de controle positivo ou controle negativo à mistura de reação de RT em uma estação de trabalho de PCR em uma sala de modelos. O controle positivo de RT é o RNA extraído da cultura de células infectada com a cepa RABV fixa CVS-11 (vírus de desafio padrão-11) e armazenado a -80 ° C. O controle negativo contém ddH2O.
- Misturar o conteúdo dos tubos RT por vértice; em seguida, centrifugar brevemente.
- Carregue os tubos de reação em um termociclador. Configure o programa de síntese de cDNA com as seguintes condições: 42 ° C por 90 min, 95 ° C por 5 min e 4 ° C em espera. Defina o volume de reação para 20 μL. Inicie a execução do RT.
2. Primeira rodada de PCR
- Mantenha os reagentes de PCR listados na Tabela 2 em gelo em uma sala limpa até o uso; em seguida, descongele-os e vortexe-os.
- Prepare a mistura de PCR de primeira rodada em um tubo de PCR de 0,2 mL com os reagentes listados na Tabela 2.
- Adicione uma amostra de 2 μL de cDNA ou plasmídeo à mistura de PCR de primeira rodada dentro de uma estação de trabalho de PCR em uma sala de modelos. O controlo positivo da PCR é o cDNA CVS-11 preparado conforme mencionado no passo 1.3 para o método RT acima referido. O controle negativo da PCR é dd H2O.
- Transfira os tubos selados para um termociclador PCR e cicle usando os parâmetros listados na Tabela 3.
3. PCR de segunda rodada
- Prepare a mistura de PCR de segunda rodada em um tubo de PCR de 0,2 mL usando os reagentes listados na Tabela 4.
- Adicione 2 μL do produto de PCR de primeira rodada à mistura de PCR de segunda rodada. Além disso, incluir dd H2O como controle negativo da PCR de segunda rodada.
- Execute o ciclo térmico de PCR usando os mesmos parâmetros fornecidos na etapa 2.4.
Tabela 1: Reagentes de transcrição reversa para síntese de cDNA.
| componente | Volume por reação (μl) |
| dNTPs (2,5 mM) | 4 |
| Primer aleatório (50 μM) | 1.5 |
| Oligo(dT) 15 (50 μM) | 0,5 |
| Buffer M-MLV (5x) | 4 |
| Transcriptase reversa M-MLV (200 UI/μL) | 1 |
| RNasina (40 UI/μL) | 1 |
| Volume total | 12 |
Tabela 2: Reagentes da PCR de primeira rodada.
| componente | Volume por reação (μl) |
| dNTPs (10 mM) | 1 |
| Ex-Taq (5 U/μL) | 0,3 |
| Tampão Taq (10x) | 5 |
| N127 (20 μM) | 1 |
| N829 (20 μM) | 1 |
| dd H2O | 39.7 |
| Volume total | 48 |
Tabela 3: Parâmetros de ciclagem da primeira e segunda rodada de PCR
| temperatura | Hora | ciclo |
| 94 °C | 2 min | 1 |
| 94 °C | 30 s | 35 |
| 56 °C | 30 s | 35 |
| 72 °C | 40 s | 35 |
| 72 °C | 10 minutos | 1 |
| 4 °C | ∞ | |
Tabela 4: Reagentes da PCR de segunda rodada.
| componente | Volume por reação (μl) |
| dNTPs (10 mM) | 1 |
| Ex-Taq (5 U/μL) | 0,3 |
| Tampão Taq (10x) | 5 |
| N371F (20 μM) | 1 |
| N371R (20 μM) | 1 |
| dd H2O | 39.7 |
| Volume total | 48 |