Artigo de método

PCR de fusão de alta resolução para determinar variações de sequência em sequências de DNA mutante

8 de julho de 2025

Neste artigo

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fonte: Kisserli, A., et al. PCR de fusão de alta resolução para genotipagem de polimorfismo de comprimento do receptor do complemento 1: uma ferramenta inovadora para avaliação de suscetibilidade gênica da doença de Alzheimer. J. Vis. Exp. (2017).

Neste vídeo, descrevemos uma técnica de PCR de fusão de alta resolução para determinar o polimorfismo de comprimento de fragmentos de DNA de comprimentos de sequência variados, com base na análise da temperatura de fusão.

Protocolo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Protocolo HRM-PCR

  1. Descongele as amostras de DNA. Diluir as amostras de DNA em tubos de 1,5 mL com água para ajustá-las a uma concentração de 10 ng/μL
    nota: O volume total de DNA diluído deve estar entre 2 μL e 10 μL.
  2. Descongele as soluções de primer. Diluir as soluções de primer em tubos de 1,5 mL com água para ajustá-los à mesma concentração de 6 μM.
    nota: As sequências de primers e as condições de reação são fornecidas na Tabela 1.
  3. Descongele as soluções do kit HRM-PCR e misture cuidadosamente por vórtice para garantir a recuperação de todo o conteúdo. Gire brevemente os três frascos contendo a mistura enzimática com corante de ligação ao DNA, MgCl2 e água em uma microcentrífuga antes de abri-los. Armazene-os em temperatura ambiente.
  4. Em um tubo de 1,5 mL à temperatura ambiente, prepare a mistura de PCR para uma reação de 20 μL adicionando os seguintes componentes na ordem listada abaixo:
    1. 10 μL de mistura enzimática com corante de ligação ao DNA;
    2. 2 μL de 25 mM MgCl2;
    3. 1 μL de primer 1,6 μM (concentração final: 300 nM);
    4. 1 μL de primer 2, 6 μM (concentração final: 300 nM); e
    5. 5 μL de água.
      nota: Para preparar a mistura de PCR para mais de uma reação, multiplique os volumes acima pelo número de reações a serem executadas, mais uma reação adicional.
  5. Misture cuidadosamente por vórtice.
  6. Pipetar 19 μL de mistura de PCR, preparada acima, em cada poço de uma placa branca de vários poços.
  7. Adicione 1 μL de molde de DNA ajustado à concentração.
    nota: Para reações de controle, sempre execute um controle negativo com as amostras. Para preparar um controle negativo, substitua o DNA molde por água.
  8. Sele a placa branca de vários poços com folha de vedação.
  9. Coloque a placa branca de poços múltiplos na centrífuga e equilibre-a com um contrapeso adequado (ou seja, outra placa de poços múltiplos). Centrifugue por 1 min a 1.500 x g em uma centrífuga de caçamba oscilante padrão contendo um rotor para placas multipoços com adaptadores adequados.
  10. Carregue a placa multipoços branca no instrumento HRM-PCR.
  11. Inicie o programa HRM-PCR com as seguintes condições de PCR:
    Desnaturação: 95 °C por 10 min; 1 ciclo.
    Amplificação: 95 °C por 10 s, 62 °C por 15s e 72 °C por 20s; 47 ciclos.
    Curva de fusão: 95 °C; taxa de rampa: 0,02 °C/s; 25 aquisições por °C; 1 ciclo.
    Resfriamento: 40 °C por 30 s; taxa de rampa 2,2 °C/s; 1 ciclo.

figure-protocol-1

Tabela 1: Primers e parâmetros usados na análise de fusão de alta resolução.

2. Análise HRM para determinar o polimorfismo de comprimento CR1

NOTA: A metodologia descrita (Figura 1) é específica para o nosso software (consulte a Tabela de Materiais), embora outros pacotes de software possam ser usados.

  1. Abra um software de varredura de genes para realizar a análise de varredura de polimorfismo de comprimento CR1.
  2. Abra o experimento que contém o programa de amplificação e o programa da curva de fusão.
  3. Clique em Editor de amostra na barra Módulo e selecione o fluxo de trabalho Digitalização.
  4. Defina as propriedades das amostras (ou seja, nome; controle desconhecido ou negativo).
  5. Clique em Análise na barra Módulo.
  6. Na lista Criar nova análise, selecione Varredura de genes.
  7. Clique na guia Normalização para normalizar as curvas de fusão.
  8. Clique na guia Mudança de temperatura para redefinir o eixo de temperatura (eixo x) das curvas de fusão.
    nota: O gráfico inferior mostra curvas de fusão que são normalizadas e deslocadas de temperatura.
  9. Clique no botão Calcular para analisar os resultados e determinar o agrupamento.
  10. Clique na guia Gráfico de diferença na área de gráficos para exibir as curvas de fusão normalizadas e deslocadas e o gráfico de diferença normalizada e deslocada de temperatura.

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Resultados

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figure-results-1
Figura 1: Capturas de tela da interface gráfica do software usado na etapa 2 do protocolo. (A) Abra o software de varredura de genes. (B) Programa de amplificação e programa de curva de fusão. (C) Clique em Editor de amostra na barra Módulo. (D) Selecione Digitalização. (E) Defina as propriedades das am...

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Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Não há conflitos de interesse declarados.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Jalecoproteção
Luvas de exame de nitrilo sem pó de gelo SensiCareMedline Industries, Inc, Mundelein, IL 60060, EUA486802Proteção da amostra
Pipeta Eppendorf Reference 2, 0,5-10μLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, França4920000024pipetagem de amostras
Pipeta Eppendorf Reference 2, 20-100μLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, França4920000059pipetagem de amostras
Pipeta Eppendorf Reference 2, 100-1000μLEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, França4920000083pipetagem de amostras
TipOne 10μL graduado, ponta de filtroStarlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, AlemanhaS1121-3810pipetagem de amostras
TipOne 1-100μL chanfrado, ponta do filtro Starlab GmbH, D-22926 Ahrenburg, AlemanhaS1120-1840pipetagem de amostras
Ponta de barreira ART 1000EThermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, França2079Epipetagem de amostras
Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1,5 mL, Qualidade EppendorfEppendorf France SAS, F-78360 Montesson, França30120086misturar
Vórtice-Gênio 2Scientific Industries, Inc, Boêmia, NY 111716, EUASI-0236misturar
Centrífuga Mikro 200Hettich Zentrifugen, D-78532, AlemanhaTelefone: 0002020-02-00centrifugação
Multipette E3Eppendorf France SAS, F-78360 Montesson, França4987000010distribuição
Light Cycler 480 placa multipoços 96, brancoRoche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Alemanha4729692001local de reação
Folha de vedação Light Cycler 480Roche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Alemanha4429757001cobertura
LightCycler 480 Instrumento II, 96 poçosRoche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Alemanha05015278001reação em cadeia da polimerase de fusão de alta resolução
Centrífuga Heraeus Megafuge 11RThermo Fischer Scientific , F-67403 Illkirch, França75004412centrifugação
LightCycler 480 Mestre de Fusão de Alta ResoluçãoRoche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Alemanha04909631001reagentes de reação
Primer CN3: 5'ggccttagacttctcctgc 3'Divisão de Produtos Biológicos da Eurogentec, B4102 Seraing, Bélgicareagente de reação
Primer CN3re: 5'gttgacaaattggcggcttcg 3'Divisão de Produtos Biológicos da Eurogentec, B4102 Seraing, Bélgicareagentes de reação
ciclador de luz 480 SW 1.5.1 softwareRoche Diagnostics GmbH, D-68305 Mannheim, Alemanhasoftware utilizado para análise de dados de polimorfismo HRM-PCR CR1

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