Reação em cadeia da polimerase de gotículas multiplex para detectar metilação do DNA em leucócitos

Resumo

Fonte: Malic, L., et al. PCR de gotículas multiplex específicas de metilação usando dispositivo gerador de gotículas de polímero para diagnóstico hematológico.J. Vis. Exp. (2020)

Este vídeo demonstra a técnica de reação em cadeia da polimerase por gotículas multiplex para a quantificação simultânea de regiões de DNA metilado em diferentes populações de glóbulos brancos como um biomarcador precoce para diagnóstico clínico e prognóstico.

Protocolo

1. Geração de gotículas e PCR

NOTA: A Tabela 1 descreve as informações sobre os primers direto e reverso junto com as sondas de hidrólise duplamente temperadas para os genes C-LESS, CD3Z e Foxp3, que são necessários para a amplificação multiplex de alvos de genes desmetilados.

1. Prepare a mistura principal conforme descrito na Tabela 2.
2. Descongele todos os componentes da mistura principal, exceto a mistura enzimática. Misture bem a mistura master pipetando para cima e para baixo e gire para baixo brevemente.
3. Adicione o volume apropriado (1 μL) de DNA convertido em bissulfito à mistura principal em um tubo de PCR. Misture a reação pipetando para cima e para baixo e gire para baixo brevemente.
4. Conecte o tubo fluídico descartável (ID 0.25 mm, OD 1.6 mm) a duas seringas de vidro de precisão (volume de 250 μL) usando conexões PEEK.
5. Pré-encha uma seringa de vidro de precisão com 250 μL de óleo transportador contendo 5% de fluoro-surfactante.
6. Encha novamente outra seringa de vidro de precisão com 50 μL de óleo transportador antes de carregar 100 μL da mistura de PCR para garantir a distribuição de todo o volume da amostra durante a emulsificação.
7. Configure um dispositivo microfluídico de gotículas em um estágio de um microscópio de luz vertical equipado com uma câmera de alta velocidade para observar e registrar a formação de gotículas em tempo real.
8. Coloque as seringas pré-cheias na bomba de seringa programável e, usando a união PEEK com as conexões (consulte a Tabela de Materiais), conecte a tubulação das seringas à tubulação dos respectivos canais de entrada do dispositivo microfluídico de gotículas.
9. Coloque a tubulação da saída do gerador de gotículas dentro de um tubo de PCR de 0,5 mL.
10. Ajuste a vazão da bomba de seringa para 2 μL/min e deixe o tamanho da gota estabilizar antes de coletar a emulsão resultante.
11. Colete a emulsão e transfira 75 μL para um tubo de PCR de 0,2 mL para ciclos térmicos.
12. Certifique-se de que o teor de óleo no tubo de PCR corresponda ao volume da fase dispersa para evitar a coalescência das gotículas durante o ciclo térmico.
13. Coloque o tubo de PCR de 0,2 mL em um termociclador e execute o protocolo de ciclagem da seguinte forma: pré-aquecimento a 95 °C por 5 min, depois 45 ciclos de desnaturação a 95 °C por 15 s e recozimento/extensão a 60 °C por 30 s.

Tabela 1: Projeto do primer e da sonda de hidrólise.

FOXP3 Avançar	GGG TTT TGT TGT TAT AGT TTT TG
FOXP3 reverso	TTC TCT TCC TCC ATA ATA TCA
CD3Z Encaminhar	GGA TGG TTG TGG TGA AAA GTG
CD3Z reverso	CAA AAA CTC CTT TTC TCC TAA CCA
C-LESS Avançar	TTG TAT GTA TGT MORDAÇA TGT GGG AGA GA
C-LESS Reverso	TTT CTT CCA CCC CTT CTC TTC C
Sonda FOXP3	/56-FAM/CA ACA CAT C/ZEN/C AAC CAC CAT /3IABkFQ/
Sonda CDZ3	/56-HEX/CC AAC CAC C/ZEN/A CTA CCT CAA /3IABkFQ/
Sonda sem C	/56-CY5/CT CCC CCT C/ZEN/T AAC TCT AT/3IABkFQ/

Tabela 2: Receita de mistura mestre para mdPCR.

Reagente	Solução de estoque	Volume da mistura principal	Concentração de trabalho
Tris-HCl	1 milhão	2 μL	20 mM
Kcl	1 milhão	10 μL	100 mM
MgCl2	25 mM	16 μL	4 mM
Primers C-LESS	10 μM	10 μL	1 μM cada
Primers CD3Z	10 μM	10 μL	1 μM cada
Primers FOXP3	10 μM	10 μL	1 μM cada
Sonda C-LESS	10 μM	5 μL	500 nM
Sonda CD3Z	10 μM	5 μL	500 nM
Sonda FOXP3	10 μM	5 μL	500 nM
HotStarTaq DNA Polimerase	5 Unidades/μL	8 μL	0,4 unidades/μL
Alvo de DNA tratado com bissulfito	variável	variável	variável
Água Livre de Nuclease		variável
Volume total		100 μL

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubo de PCR	Bio-Rad, Mississauga, ON	TFI0201
Fluoro-surfactante	RAN Biotechnologies, Beverly, MA	008-FluoroSurfactante
Tubos fluídicos descartáveis	dolomita	3200063
Tubos fluídicos descartáveis	dolomita	3200302
Conexões PEEK	IDEX Saúde e Ciência, Oak Harbor, WA	Pág. 881
Óleo transportador	3M, São Paulo, MN
Microscópio de luz vertical	Nikon, Melville, NY