1. Controle de Qualidade do DNA Genômico
NOTA: O DNA genômico (gDNA) foi extraído do sangue periférico usando o método de purificação de DNA baseado em membrana de sílica bem estabelecido. Antes dos procedimentos abaixo, a concentração de gDNA foi determinada usando um espectrofotômetro.
- Preparar a amostra de ADNg a uma concentração de 10-100 ng/μl.
- Adicione 10 μL de tampão de amostra de DNA a uma tira de 8 tubos.
- Adicione 1 μL de escada de DNA ou gDNA aos tubos. Vortex a mistura por 1 min usando o acessório de microplaca.
- Carregue o tubo, o dispositivo de gel e as pontas da pipeta no instrumento de eletroforese (Tabela de Materiais) e inicie a corrida pressionando o botão 'Iniciar'.
nota: O sistema de eletroforese funcionará automaticamente com um clique no botão Iniciar.
- Confirme se o marcador inferior contido no tampão da amostra de ADN está correctamente atribuído nos electroferogramas. Se estiver atribuído incorretamente, atribua manualmente o marcador no 'Modo eletro-herograma' do software.
nota: O número de integridade do DNA (DIN) será calculado automaticamente. O valor DIN vem da integridade do DNA. Valores DIN altos e baixos indicam gDNA altamente intacto e fortemente degradado, respectivamente.
- Especifique a região de tamanho do gDNA (> 200 pb) no 'modo de região' do software para calcular automaticamente a concentração de gDNA (> 200 bp).
2. Projeto de primer e sonda
- Calcule os valores da temperatura de fusão (Tm) usando qualquer ferramenta de acesso aberto nas seguintes condições: 10-25 bases, 50 mM Na+/K+, 0.80 mM dNTPs e 3 mM Mg2+ (Tabela de Materiais). Projete os primers direto e reverso para amplificar a região genômica contendo alelos-alvo com o valor Tm em torno de 60 ° C e o comprimento do amplicon em 100-300 bp.
NOTA: Consulte a Tabela 1 para a concentração de oligonucleotídeos.
- Projete as sondas de ácido nucleico bloqueado (LNA) para os alelos de referência e variantes com base nas seguintes condições: (i) 1-6 LNAs estão presentes em cada sonda; (ii) um corante fluorescente e um extintor estão presentes nos terminais 5' e 3' de cada sonda, respectivamente; iii) a diferença entre os valores Tm das sondas de comparação e de incompatibilidade é > 10 °C; (iv) Os valores de Tm das sondas combinadas e incompatíveis são maiores e menores do que os dos primers, respectivamente [por exemplo, primer direto: 60,8 ° C, primer reverso: 59,8 ° C, sonda de alelo de referência (compatível/incompatível): 62,6/45,3 °C, sonda de alelo variante (compatível/incompatível): 61,7/50,5 °C]. Os valores de Tm foram calculados usando a ferramenta de acesso aberto também usada para a etapa 2.1.
- Certifique-se de que os primers e sondas projetados não abranjam os polimorfismos de nucleotídeo único com uma frequência de > 0,1%, conforme determinado a partir de bancos de dados [por exemplo, o banco de dados de polimorfismo de nucleotídeo único (dbSNP)].
3. PCR digital
- Preparar os iniciadores, as sondas e as soluções-mãe de ADNg nas concentrações descritas no quadro 1 com um tampão TE e conservá-los a -20–4 °C.
- Misturar os reagentes à temperatura ambiente num volume total de 15 μL até obter uma concentração final conforme descrito no quadro 1.
- Adicione 3 μL de água destilada em vez de gDNA em um controle sem modelo (NTC).
- Prepare 3,5x a quantidade da mistura de PCR em triplicata para levar em conta o erro de pipetagem.
- Pipete a mistura de PCR para cima e para baixo para misturá-la.
- Coloque a plataforma de carregamento nos cavacos construídos na tira de 8 tubos e coloque-os no carregador automático. Certifique-se de que haja contato entre o chip e a plataforma de carregamento.
- Encaixe um controle deslizante de carregamento na plataforma e segure o controle deslizante com o batente fora do carregador.
- Pipetar 15 μL da mistura de PCR na plataforma perto da ponta do controle deslizante (Figura 1A).
- Execute o carregador pressionando o botão do carregador (por aproximadamente 1 min).
nota: Não é um problema se uma pequena quantidade de mistura de PCR permanecer na plataforma. É possível executar novamente o carregador sequencialmente.
- Coloque o chip em um tubo preenchido com a mistura de PCR na ranhura lateral do intensificador de vedação. Empurre a tampa deslizante e a borda da tampa superior para não quebrar o chip (Figura 1B).
- Execute o intensificador de vedação (aproximadamente 2 min). Execute sequencialmente o intensificador de vedação por 1 min se uma poça de líquido ainda estiver visível porque uma vedação incompleta causa contaminação cruzada dos sinais positivos (Figuras 1C e 1D).
- Adicione 230 μL de fluido de vedação, um reagente à base de óleo, aos tubos.
nota: Os chips agora devem ser imersos no fluido.
- Coloque os tubos no termociclador. Execute o termociclador conforme descrito na Tabela 2 (por aproximadamente 2 h). Ajuste a temperatura ou a duração da PCR se houver uma distribuição desigual de partições positivas (Figura 1E).
NOTA: Recomenda-se definir o ramp taxa para cerca de 1 °C/s.
- Deixe os tubos no termociclador por pelo menos 15 min para reduzir o ruído da linha de base.
nota: Os tubos também podem ser deixados durante a noite. Sinais de fluorescência foram detectados ainda no dia seguinte.
- Coloque os tubos no gabarito de detecção e despeje 6 mL de água destilada no gabarito. Se houver bolhas de ar visíveis dentro e fora dos tubos, limpe-as (Figuras 1F e 1G).
- Carregue o gabarito no detector e execute-o com um clique no botão 'Executar' do software após a seleção das guias Fluorescência, Experimento e Amostra/NTC (Tabela de Materiais).
NOTA: A detecção de duas cores de oito amostras com uma intensidade padrão leva aproximadamente 4 a 5 minutos.
- Confirme o gráfico de posição, histograma e gráfico de dispersão 2D.
NOTA: Se a intensidade de fluorescência das partições negativas for alta, ajuste a intensidade com um clique no botão Configurações do software para que fique dentro da faixa de 30 a 70.
- Calcular a fração alélica variante (FAV) utilizando a seguinte fórmula:
Aqui, Cv e Cr são os números de cópia da variante e do alelo de referência, respectivamente.
nota: Eles são calculados automaticamente no programa de software com base nas estatísticas de Poisson.
4. Coleta do produto PCR
- Remova o fluido de vedação do tubo.
- Adicione 100 μL de tampão TE ao tubo. Vortex vigorosamente por 30 s e centrifugue brevemente o tubo.
- Transferir a solução de TE para outro tubo e adicionar 30 μL de acetato de sódio 3 M e 200 μL de etanol.
- Arrefecer a solução a -20 °C durante a noite.
- Centrifugue a solução por 30 min a 16.000 x g e remova o sobrenadante.
- Adicione 300 μL de etanol a 80% ao tubo e ao vórtice.
- Centrifugue a solução por 15 min a 16.000 x g e remova o sobrenadante. Deixe o precipitado secar ao ar por 5 min.
- Dissolva o precipitado em 1–5 μL de tampão TE após secagem ao ar.
- Se necessário, avalie o tamanho do produto usando um instrumento de eletroforese com referência à etapa 1. Carregue 1 μL da solução no dispositivo de gel para uma alta sensibilidade (Tabela de Materiais).
