PCR digital baseado em chip para detectar variantes raras de transcrição usando um chip nanofluídico

Abstract

Fonte: Molinari, C., et al. Detecção de uma variante de transcrição rara de CDH1 em tecidos de câncer gástrico recém-congelados por PCR digital baseado em chip. J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo demonstra a PCR digital baseada em chip — uma variação da técnica de PCR digital que é útil na detecção de variantes raras de transcrição. A reação de PCR é particionada nas câmaras de um chip nanofluídico, cada um dos quais atua como uma reação independente. A detecção de sinais de fluorescência das câmaras com alvos amplificados confirma a presença de variantes raras de transcrição na amostra.

Protocol

Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.

NOTA: Este procedimento foi projetado especificamente para a detecção de um baixo número de moléculas de cDNA em tecidos humanos recém-congelados. As seções de tecido foram cortadas em gelo seco, enquanto ainda congeladas, de amostras de tumor gástrico derivado de pacientes previamente validadas ou de tecido normal.

1. Isolamento e Purificação de RNA

1. ....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagente de TRIazol	Thermo Fisher Científico	15596018
Glicogênio 20 mg/ml	Roche	10901393001
Kit de limpeza RNeasy MinElute	QIAGEN	Rolamento 74204
Kit de síntese de cDNA iScript	BioRad	1708891
QuantStudio 3D Digital PCR Master Mix v2	Thermo Fisher Científico	A26358
Ensaio personalizado CDH1a IDT	Tecnologias Integradas de DNA (IDT)	NA	F) GCTGCAGTTTCACTTTTAGTG (R) ACTTTGAATCGGGTGTCGAG (P)/FAM/CGGTCGACAAAGGACAGCCTATT/TAMRA/ [Concentrações de ensaio otimizadas para dPCR: 900 nM (F), 900 nM (R), 250 nM (P)]
Kit de Chip QuantStudio 3D Digital PCR 20K v2	Thermo Fisher Científico	A26316
Afresco de Heraeus Biofuga	Thermo Científico	75002402
Termociclador (Labcycler)	Sensoquest	Nº 011-103
Sistema de PCR GeneAmp 9700	Thermo Fisher Científico	N805-0200
Módulo de amostra de bloco plano duplo	Thermo Fisher Científico	4425757
Base de inclinação QuantStudio 3D para sistema de PCR GeneAmp de bloco plano duplo 9700	Thermo Fisher Científico	4486414
Kit Adaptador de Chip PCR Digital 3D QuantStudio para Termociclador de Bloco Plano	Thermo Fisher Científico	4485513
QuantStudio 3D Digital PCR Chip Loader	Thermo Fisher Científico	4482592
Instrumento de PCR Digital 3D QuantStudio com cabo de alimentação	Thermo Fisher Científico	4489084