$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Todos os procedimentos envolvendo participantes humanos foram realizados em conformidade com as diretrizes institucionais, nacionais e internacionais para o bem-estar humano e foram revisados pelo conselho de revisão institucional local.
NOTA: Este procedimento foi projetado especificamente para a detecção de um baixo número de moléculas de cDNA em tecidos humanos recém-congelados. As seções de tecido foram cortadas em gelo seco, enquanto ainda congeladas, de amostras de tumor gástrico derivado de pacientes previamente validadas ou de tecido normal.
1. Isolamento e Purificação de RNA
- Extração de RNA
nota: O isolamento de RNA é realizado sob o capô usando um produto específico (consulte a Tabela de Materiais). No entanto, uma variedade de kits de isolamento está disponível comercialmente.
- Homogeneizar 50 - 100 mg de uma amostra de tecido fresco congelado finamente cortada em um tubo de 1,5 mL com 1 mL do reagente de isolamento de RNA e vórtice vigorosamente por 15 s. Incubar os tubos a -80 ° C durante a noite.
- Incubar o tubo que contém a amostra à temperatura ambiente durante 5 minutos e misturar por vórtice durante 15 segundos.
- Mantenha o tubo no gelo, adicione 200 μL de clorofórmio e vortex vigorosamente por 15 s.
- Incubar os tubos à temperatura ambiente durante 60 s e centrifugá-los a 12.000 x g durante 15 min a 4 °C.
- Transferir a fase aquosa para um tubo de 1,5 mL e adicionar 20 μg de glicogênio.
nota: É importante evitar cuidadosamente a transferência de qualquer uma das camadas interfásicas ou orgânicas para reduzir a contaminação.
- Adicione 500 μL de isopropanol, invertendo o tubo para misturar, e incube no gelo por 10 min.
- Centrifugue o tubo a 12.000 x g por 15 min a 4 °C para precipitar RNA.
nota: O RNA estará presente em um pellet semelhante a um gel na lateral e no fundo do tubo, muitas vezes invisível após a centrifugação.
- Remover o sobrenadante sem perturbar o precipitado e lavá-lo com 1 ml de etanol a 75% por pipetagem.
- Centrifugar o tubo a 7.500 x g durante 5 min a 4 °C e remover o sobrenadante sem perturbar o sedimento.
- Deixe o pellet secar até que o precipitado fique transparente e dissolva-o em 50 μL de água livre de RNase.
- Congelar as amostras a -80 °C pelo menos durante a noite antes da quantificação.
- Eliminação de DNA genômico e purificação de RNA
nota: Uma etapa de digestão de DNase, seguida por uma purificação de RNA baseada em coluna, é recomendada para análises de alvos de baixa abundância, a fim de digerir o DNA contaminante.
- Dissolva a DNase I liofilizada (1.500 unidades Kunitz) em 550 μL de água livre de RNase usando uma seringa, misture delicadamente invertendo o frasco e divida a solução estoque reconstituída em alíquotas.
- Transfira em um tubo de 1,5 mL o volume calculado da amostra com 15 μg de RNA, 10 μL de tampão de digestão DNase do kit (listado na Tabela de Materiais), 2,5 μL de solução estoque de DNase I e água livre de RNase para 100 μL. Incubar em temperatura ambiente por 10 min.
- Adicione 350 μL de tampão de lise tecidual (do kit, consulte a Tabela de Materiais) e misture por pipetagem.
- Adicione 250 μL de etanol 100% e misture por pipetagem.
- Transfira todo o volume (700 μL) para uma nova coluna de centrifugação e centrifugue a 12.000 x g por 15 s.
- Transfira o filtro para um novo tubo de coleta, adicione 500 μL de etanol a 80% à coluna e centrifugue a 12.000 x g por 2 min.
- Abra a tampa da coluna de centrifugação e centrifugue a 12.000 x g por 5 min com um novo tubo de coleta para secar o filtro; em seguida, transfira o filtro para um tubo de 1,5 mL.
- Adicione 14 μL de água livre de RNase diretamente à coluna do filtro e centrifugue a 12.000 x g por 1 min.
- Manter as amostras congeladas e proceder à quantificação utilizando 2 μl da amostra num espectrofotómetro de bancada ou armazenar o ARN a -80 °C até à utilização.
2. Configuração de reação de PCR digital
- Mistura de reação de dPCR e preparação de amostras
- Descongele a mistura principal e o ensaio à temperatura ambiente durante pelo menos 20 min.
- Diluir as amostras de cDNA até uma concentração de 300 ng em 6 μL de água.
- Agite suavemente a mistura principal e prepare a mistura em um tubo estéril com 8,7 μL de mistura principal, 0,87 μL do primer de ensaio personalizado CDH1a e 1,83 μL de água livre de nuclease para um volume final de 11,4 μL.
nota: Para obter detalhes do primer de ensaio personalizado CDH1a, consulte a Tabela de Materiais.
- Transfira 11,4 μL da mistura preparada para a amostra de cDNA diluída, misture suavemente e centrifugue brevemente.
nota: Os volumes incluem 20% de excesso para compensar a perda de volume da pipetagem. Prepare a mistura para todas as amostras e um controle sem modelo (NTC).
- Preparação de chips
Nota: Para obter os melhores resultados, carregue os chips o mais rápido possível.
- Conecte o carregador de chips e espere até que a luz indicadora fique verde.
- Remova a tampa da seringa de fluido de imersão puxando suavemente o êmbolo 1 - 2 mm para trás e soltando-o para facilitar esta etapa e substitua-o por uma ponta.
- Pegue um novo chip e anote o código escrito na tampa para associá-lo à amostra.
- Segure a tampa cuidadosamente ao lado, retire a película protetora e coloque a tampa com a face adesiva voltada para cima na orientação correta.
- Pegue um cavaco com cuidado, tomando cuidado para não tocar na parte interna, e carregue-o no ninho de cavacos na posição correta pressionando a alavanca para abrir o clamp.
- Carregue uma nova lâmina de carregamento na carregadeira e empurre-a suavemente para garantir que esteja firmemente no lugar.
- Transfira 14,5 μL da mistura de reação dPCR para a lâmina de carregamento sem fazer bolhas de ar ou desviar a lâmina, após o que pressione o botão de carregamento preto para distribuir o volume no chip.
- Use a seringa de fluido de imersão para transferir cerca de 20 gotas para a superfície do cavaco, tomando cuidado para não tocar na superfície com a ponta.
nota: É importante cobrir toda a superfície sem derramar fluido nas bordas.
- Gire o braço do carregador para fazer a tampa entrar em contato com o chip e pressione para baixo por 15 s.
- Pressione o botão da tampa para liberar o chip e retornar o braço à sua posição.
- Segure o chip montado em um ângulo de 45° e dispense cuidadosamente o fluido de imersão com a seringa através da porta de enchimento, gire o chip levemente para garantir que não haja bolhas de ar e remova qualquer excesso de fluido com um pano estéril.
- Feche a caixa de aparas retirando suavemente a etiqueta na parte superior da tampa de aparas e pressione sobre a porta de enchimento durante pelo menos 5 s.
- Armazene o chip no escuro até que esteja pronto para carregar no termociclador.
nota: Os chips preparados devem ser usados dentro de 2 h.
- reação de dPCR
- Abra a tampa e instale os adaptadores em ambos os blocos, mesmo quando um único bloco for usado.
- Coloque os chips no bloco de amostra na posição correta.
nota: A porta de enchimento deve ser orientada para a frente do termociclador em uma posição elevada para permitir que quaisquer bolhas de ar flutuem para o topo sem perturbar a janela do chip. Use fichas vazias para equilibrar os dois blocos.
- Coloque a almofada térmica no sample bloco para cobrir completamente os chips.
- Feche a tampa e inicie a corrida de PCR, aplicando as seguintes condições: manter a 96 °C por 10 min; 45 ciclos de 60 °C por 2 min e 98 °C por 30 s; manter a 60 °C por 2 min; manter a 4 °C. Desligar o termociclador e descongelar os cavacos em temperatura ambiente por pelo menos 10 min.
nota: A análise de cavacos deve ser realizada dentro de uma hora.
- Análise de cavacos
- Abra a tampa do instrumento e remova as almofadas térmicas, em seguida, remova os chips dos adaptadores.
nota: Armazene os chips em um local escuro e limpo até a análise.
- Limpe a superfície do cavaco com isopropanol e um lenço estéril.
nota: Inspecione cada chip quanto a vazamentos ou possíveis problemas.
- Insira o USB no sistema detector para salvar os dados.
- Abra a bandeja de cavacos do sistema detector, carregue o cavaco virado para cima na posição correta e feche a bandeja.
- Aguarde 30 s para o processamento, remova o chip e insira o próximo.
- Aguarde a conclusão da análise de todos os chips processados e insira o USB em um computador para transferir os arquivos.
nota: O tempo total para análise é de cerca de 2 a 3 min/chip.
3. Análise e interpretação dos dados
- Conecte-se à plataforma de software baseada em nuvem necessária para realizar todas as análises downstream.
- Crie um projeto e importe todos os arquivos de dados dos chips de interesse.
- Digite o nome da amostra; selecione o corante e o ensaio usados na guia "Definir chips".
- Determine se o chip é aceitável visualizando-o na guia "Revisar dados", verificando o quão completamente a amostra foi carregada no chip e quantos pontos de dados são avaliáveis.
nota: Rejeite chips com menos de 13.000 pontos de dados avaliáveis.
- Passe para o gráfico de dispersão do chip selecionado no lado direito da tela; aplique um limite de 6.000 para os sinais de corante repórter de amidita fluoresceína (FAM) (eixo Y) a todos os chips.
nota: A configuração do limiar pode variar com base nos ensaios utilizados.
- Remova quaisquer sinais positivos duvidosos para evitar resultados falsos positivos, selecionando o ponto relativo no gráfico de dispersão usando a ferramenta laço e pressionando "indeterminado". Todos os pontos positivos restantes indicam a presença de cópias de cDNA do alvo raro analisado.