Ensaio de Dot Blot para quantificar o genoma viral

NOTA: As receitas para as soluções e buffers necessários para este protocolo são fornecidas na Tabela 1.

1. Mancha de pontos

1. Preparação de padrões de DNA de plasmídeo
   1. Diluir o DNA do plasmídeo do genoma do vetor AAV a 10 ng/μL em água ou tampão Tris-HCl (10 mM, pH 8,0). Tomar 25 μL desta diluição e digerir com uma enzima de restrição apropriada durante 1 h para linearizar o ADN do plasmídeo num volume de reacção de 50 μL.
      nota: Fazemos um conjunto duplicado de digestão (consulte a etapa 1.4.1). A enzima apropriada deve ser aquela que corta o DNA do plasmídeo fora da região de ligação à sonda de dot blot. Por conveniência, o DNA do plasmídeo diluído pode ser aliquotado (25 μL / tubo) e armazenado congelado a -20 ° C para uso futuro. Digerir o ADN do plasmídeo enquanto os tubos estão a agitar no passo 5.1. Não digerir em excesso o padrão de ADN do plasmídeo.
   2. Adicionar 450 μL de água ou TE ao tubo que contém o padrão de ADN do plasmídeo digerido e homogeneizar. Transfira 70 μL dessa mistura para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL com 1.330 μL de água ou TE para fazer um padrão de plasmídeo diluído (25 pg/μL).
   3. Siga a Tabela 1 para criar um conjunto de diluições seriais duplas (600 μL / tubo). Misturar bem as diluições por vórtice durante 5 s.
2. Desnaturação de padrões e amostras de DNA viral
   1. Adicione 600 μL de solução alcalina 2x a cada diluição padrão. Misture bem por vórtice por 5 a 10 s. Incubar à temperatura ambiente durante 10 min.
   2. Adicione 120 μL de solução alcalina 2x a cada amostra de DNA viral. Misture bem por vórtice por 5 a 10 s. Incubar à temperatura ambiente durante 10 min.
3. Configurando o aparelho de dot blot
   1. Usando uma tesoura, corte uma membrana de borrão (por exemplo, sonda zeta) em um tamanho apropriado para o número de amostras e padrões. Mergulhe a membrana com água por 10 minutos antes de colocá-la em um aparelho de mancha de pontos. Cubra os poços não utilizados no aparelho de membrana.
      nota: Manuseie a membrana com uma pinça limpa. Para cobrir poços vazios, pode-se usar a folha de proteção azul claro que acompanha a membrana. Não deixe a membrana secar antes de ligar amostras e padrões. Para obter mais detalhes sobre a montagem e uso do aparelho, consulte o manual do usuário.
   2. Adicione água aos poços para os quais as amostras serão carregadas. Aplique vácuo e puxe a água pelos poços para verificar se há erros e teste novamente quando corrigido. Reaperte os parafusos enquanto aplica vácuo para garantir uma vedação hermética.
      nota: A vedação incompleta pode causar vazamento de amostra entre os poços.
   3. Assim que a água estiver completamente puxada, libere o vácuo completamente (ou seja, o coletor de vácuo deve estar aberto à pressão do ar).
4. Carregando padrões e amostras para o aparelho de dot blot
   1. Aplique 400 μL de cada padrão de DNA de plasmídeo diluído em cada poço e execute quatro pistas de diluições padrão. Utilizar duas alíquotas separadas do resumo padrão e colocar cada uma delas em duplicado. Aplicar 200 μL/poço de cada amostra de DNA viral.
      nota: Usando os ~ 40 μL restantes de amostras desnaturadas, as amostras diluídas podem ser preparadas (por exemplo, amostras diluídas 10 vezes usando 20 μL da amostra mais 180 μL de 1x solução alcalina) e borradas, se necessário.
   2. Aplique um vácuo suave para puxar as soluções de DNA através do poço.
      nota: A pressão de vácuo precisa ser ajustada abrindo parcialmente uma válvula de três vias para que a pressão de vácuo seja aplicada ao aparelho de dot blot, bem como à atmosfera (ou seja, com os braços da torneira posicionados em um ângulo de aproximadamente 45° onde faz um ruído de sucção mais alto).
   3. Depois que todos os poços forem esvaziados, libere o vácuo ajustando a válvula de três vias. Adicione 400 μL de solução alcalina 1x a cada poço que continha padrões e amostras. Aguarde 5 minutos antes de reaplicar o vácuo para esvaziar os poços.
   4. Reaplique o vácuo da mesma maneira.
   5. Desmonte o aparelho de mancha de pontos sob o vácuo, remova a membrana e enxágue-a com 2x SSC. Coloque a membrana em uma toalha de papel limpa com o lado ligado ao DNA voltado para cima para remover o excesso de 2x SSC.
   6. Reticulação UV do DNA borrado à membrana com um reticulador UV apropriado; a membrana agora está pronta para hibridização.
      nota: As membranas úmidas podem ser usadas para reticulação UV. As membranas secas e reticuladas por UV podem ser armazenadas em temperatura ambiente. Mais informações podem ser encontradas na Tabela de Materiais.

2. Hibridização e lavagem

1. Aqueça o tampão de hibridização em banho-maria a 65 °C.
2. Marcar enzimaticamente uma sonda de DNA com ^α-32P dCTP radioativo e purificá-la usando kits disponíveis comercialmente de acordo com a recomendação do fabricante.
   nota: Usamos uma sonda de 0,5 a 2,0 kb de comprimento de uma região promotora de intensificação ou de uma sequência codificadora de proteína no genoma viral. Embora este protocolo utilize ³²sondas radioativas marcadas com P para detecção de sinal, sondas quimioluminescentes ou fluorescentes não radioativas também podem ser usadas (consulte a seção Discussão).
3. Coloque a membrana em um frasco de hibridização com o lado ligado ao DNA para cima, enxágue a membrana com 5 mL de tampão de hibridização pré-aquecido e descarte o tampão. Em seguida, adicione 10 mL de tampão de hibridização pré-aquecido e coloque a garrafa em um forno de hibridização rotativo regulado a 65 °C. Gire por ≥5 min.
4. Desnature por calor 20 μL de 10 mg / mL de solução de DNA de arenque tosquiado ou esperma de salmão e a sonda marcada com ³²P (≥10⁷ cpm) por 5 min, colocando os tubos em um bloco de calor ajustado a 100 ° C. Em seguida, resfrie-os no gelo por ≥2 min, gire brevemente e mantenha-os no gelo até o uso.
   cuidado: Para sondas de DNA radioativo, devem ser usados tubos de 1,5 mL com tampas de rosca e anéis de vedação.
5. Adicione rapidamente o DNA do esperma desnaturado e a sonda radioativa ao tampão de hibridização no frasco de hibridização e agite o frasco por 10 s para misturar. Retorne a garrafa ao forno a 65 °C e incube a garrafa com rotação a 65 °C por ≥4 h.
6. Quando a hibridização estiver concluída, pare a rotação, remova o frasco de hibridização e, em seguida, despeje a solução de sonda radioativa em um tubo cônico de 50 mL com uma tampa de vedação de plugue à prova de vazamentos. Armazene a sonda em um recipiente apropriado colocado em uma geladeira designada para materiais radioativos.
   nota: O tampão de hibridização usado com uma sonda armazenada a 4 °C pode ser reutilizado pelo menos 5 vezes colocando o tubo cônico de 50 mL com uma tampa de vedação à prova de vazamentos que contém o tampão de hibridização em um banho-maria a 100 °C por 5 min.
7. Lave a membrana com Wash Buffer aquecido a 65 °C. Adicione 20 a 30 mL de Wash Buffer ao frasco de hibridização e gire por 5 min. Repita esta lavagem mais 2 vezes.
   nota: Meça a radioatividade das soluções de lavagem e registre-a, se exigido pelo instituto local.
8. Enquanto lava a membrana, coloque uma tela de imagem de fósforo em uma borracha de imagem por 5 min.
9. Após a terceira lavagem, remova a membrana do frasco de hibridização, remova o excesso de tampão da membrana com toalhas de papel e coloque a membrana em um suporte de papel plástico transparente. Verifique os sinais radioativos na membrana usando um contador Geiger. Exponha a tela de imagem de fósforo apagada à membrana por 10 minutos a uma noite, dependendo da intensidade do sinal.
10. Digitalize a tela usando um sistema de varredura de imagem de fósforo e obtenha os dados sobre a intensidade do sinal de cada ponto.

Tabela 1: Padrões quantitativos de DNA de plasmídeo de dot blot. São mostrados os volumes necessários de solução padrão de DNA de plasmídeo de 25 pg/μL e água ou TE para preparar padrões de DNA de plasmídeo por diluições seriais duplas (600 μL/tubo). Os números na coluna padrão de DNA do plasmídeo (0,039 a 5 ng) são a quantidade de DNA em 200 μL de cada solução padrão de DNA de plasmídeo.