Ensaio de Dot Blot para quantificar o genoma viral

Resumo

Fonte: Powers, J. M. et al., Um ensaio quantitativo de dot blot para titulação de AAV e seu uso para avaliação funcional das proteínas ativadoras de montagem de vírus adeno-associadas.J. Vis. Exp. (2018).

Neste vídeo, descrevemos o ensaio de dot blot para quantificar um genoma viral. A intensidade do sinal está diretamente relacionada à quantidade de DNA viral na amostra.

Protocolo

NOTA: As receitas para as soluções e buffers necessários para este protocolo são fornecidas na Tabela 1.

1. Mancha de pontos

1. Preparação de padrões de DNA de plasmídeo
   1. Diluir o DNA do plasmídeo do genoma do vetor AAV a 10 ng/μL em água ou tampão Tris-HCl (10 mM, pH 8,0). Tomar 25 μL desta diluição e digerir com uma enzima de restrição apropriada durante 1 h para linearizar o ADN do plasmídeo num volume de reacção de 50 μL.
      nota: Fazemos um conjunto duplicado de digestão (consulte a etapa 1.4.1). A enzima apropriada deve ser aquela que corta o DNA do plasmídeo fora da região de ligação à sonda de dot blot. Por conveniência, o DNA do plasmídeo diluído pode ser aliquotado (25 μL / tubo) e armazenado congelado a -20 ° C para uso futuro. Digerir o ADN do plasmídeo enquanto os tubos estão a agitar no passo 5.1. Não digerir em excesso o padrão de ADN do plasmídeo.
   2. Adicionar 450 μL de água ou TE ao tubo que contém o padrão de ADN do plasmídeo digerido e homogeneizar. Transfira 70 μL dessa mistura para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 mL com 1.330 μL de água ou TE para fazer um padrão de plasmídeo diluído (25 pg/μL).
   3. Siga a Tabela 1 para criar um conjunto de diluições seriais duplas (600 μL / tubo). Misturar bem as diluições por vórtice durante 5 s.
2. Desnaturação de padrões e amostras de DNA viral
   1. Adicione 600 μL de solução alcalina 2x a cada diluição padrão. Misture bem por vórtice por 5 a 10 s. Incubar à temperatura ambiente durante 10 min.
   2. Adicione 120 μL de solução alcalina 2x a cada amostra de DNA viral. Misture bem por vórtice por 5 a 10 s. Incubar à temperatura ambiente durante 10 min.
3. Configurando o aparelho de dot blot
   1. Usando uma tesoura, corte uma membrana de borrão (por exemplo, sonda zeta) em um tamanho apropriado para o número de amostras e padrões. Mergulhe a membrana com água por 10 minutos antes de colocá-la em um aparelho de mancha de pontos. Cubra os poços não utilizados no aparelho de membrana.
      nota: Manuseie a membrana com uma pinça limpa. Para cobrir poços vazios, pode-se usar a folha de proteção azul claro que acompanha a membrana. Não deixe a membrana secar antes de ligar amostras e padrões. Para obter mais detalhes sobre a montagem e uso do aparelho, consulte o manual do usuário.
   2. Adicione água aos poços para os quais as amostras serão carregadas. Aplique vácuo e puxe a água pelos poços para verificar se há erros e teste novamente quando corrigido. Reaperte os parafusos enquanto aplica vácuo para garantir uma vedação hermética.
      nota: A vedação incompleta pode causar vazamento de amostra entre os poços.
   3. Assim que a água estiver completamente puxada, libere o vácuo completamente (ou seja, o coletor de vácuo deve estar aberto à pressão do ar).
4. Carregando padrões e amostras para o aparelho de dot blot
   1. Aplique 400 μL de cada padrão de DNA de plasmídeo diluído em cada poço e execute quatro pistas de diluições padrão. Utilizar duas alíquotas separadas do resumo padrão e colocar cada uma delas em duplicado. Aplicar 200 μL/poço de cada amostra de DNA viral.
      nota: Usando os ~ 40 μL restantes de amostras desnaturadas, as amostras diluídas podem ser preparadas (por exemplo, amostras diluídas 10 vezes usando 20 μL da amostra mais 180 μL de 1x solução alcalina) e borradas, se necessário.
   2. Aplique um vácuo suave para puxar as soluções de DNA através do poço.
      nota: A pressão de vácuo precisa ser ajustada abrindo parcialmente uma válvula de três vias para que a pressão de vácuo seja aplicada ao aparelho de dot blot, bem como à atmosfera (ou seja, com os braços da torneira posicionados em um ângulo de aproximadamente 45° onde faz um ruído de sucção mais alto).
   3. Depois que todos os poços forem esvaziados, libere o vácuo ajustando a válvula de três vias. Adicione 400 μL de solução alcalina 1x a cada poço que continha padrões e amostras. Aguarde 5 minutos antes de reaplicar o vácuo para esvaziar os poços.
   4. Reaplique o vácuo da mesma maneira.
   5. Desmonte o aparelho de mancha de pontos sob o vácuo, remova a membrana e enxágue-a com 2x SSC. Coloque a membrana em uma toalha de papel limpa com o lado ligado ao DNA voltado para cima para remover o excesso de 2x SSC.
   6. Reticulação UV do DNA borrado à membrana com um reticulador UV apropriado; a membrana agora está pronta para hibridização.
      nota: As membranas úmidas podem ser usadas para reticulação UV. As membranas secas e reticuladas por UV podem ser armazenadas em temperatura ambiente. Mais informações podem ser encontradas na Tabela de Materiais.

2. Hibridização e lavagem

1. Aqueça o tampão de hibridização em banho-maria a 65 °C.
2. Marcar enzimaticamente uma sonda de DNA com ^α-32P dCTP radioativo e purificá-la usando kits disponíveis comercialmente de acordo com a recomendação do fabricante.
   nota: Usamos uma sonda de 0,5 a 2,0 kb de comprimento de uma região promotora de intensificação ou de uma sequência codificadora de proteína no genoma viral. Embora este protocolo utilize ³²sondas radioativas marcadas com P para detecção de sinal, sondas quimioluminescentes ou fluorescentes não radioativas também podem ser usadas (consulte a seção Discussão).
3. Coloque a membrana em um frasco de hibridização com o lado ligado ao DNA para cima, enxágue a membrana com 5 mL de tampão de hibridização pré-aquecido e descarte o tampão. Em seguida, adicione 10 mL de tampão de hibridização pré-aquecido e coloque a garrafa em um forno de hibridização rotativo regulado a 65 °C. Gire por ≥5 min.
4. Desnature por calor 20 μL de 10 mg / mL de solução de DNA de arenque tosquiado ou esperma de salmão e a sonda marcada com ³²P (≥10⁷ cpm) por 5 min, colocando os tubos em um bloco de calor ajustado a 100 ° C. Em seguida, resfrie-os no gelo por ≥2 min, gire brevemente e mantenha-os no gelo até o uso.
   cuidado: Para sondas de DNA radioativo, devem ser usados tubos de 1,5 mL com tampas de rosca e anéis de vedação.
5. Adicione rapidamente o DNA do esperma desnaturado e a sonda radioativa ao tampão de hibridização no frasco de hibridização e agite o frasco por 10 s para misturar. Retorne a garrafa ao forno a 65 °C e incube a garrafa com rotação a 65 °C por ≥4 h.
6. Quando a hibridização estiver concluída, pare a rotação, remova o frasco de hibridização e, em seguida, despeje a solução de sonda radioativa em um tubo cônico de 50 mL com uma tampa de vedação de plugue à prova de vazamentos. Armazene a sonda em um recipiente apropriado colocado em uma geladeira designada para materiais radioativos.
   nota: O tampão de hibridização usado com uma sonda armazenada a 4 °C pode ser reutilizado pelo menos 5 vezes colocando o tubo cônico de 50 mL com uma tampa de vedação à prova de vazamentos que contém o tampão de hibridização em um banho-maria a 100 °C por 5 min.
7. Lave a membrana com Wash Buffer aquecido a 65 °C. Adicione 20 a 30 mL de Wash Buffer ao frasco de hibridização e gire por 5 min. Repita esta lavagem mais 2 vezes.
   nota: Meça a radioatividade das soluções de lavagem e registre-a, se exigido pelo instituto local.
8. Enquanto lava a membrana, coloque uma tela de imagem de fósforo em uma borracha de imagem por 5 min.
9. Após a terceira lavagem, remova a membrana do frasco de hibridização, remova o excesso de tampão da membrana com toalhas de papel e coloque a membrana em um suporte de papel plástico transparente. Verifique os sinais radioativos na membrana usando um contador Geiger. Exponha a tela de imagem de fósforo apagada à membrana por 10 minutos a uma noite, dependendo da intensidade do sinal.
10. Digitalize a tela usando um sistema de varredura de imagem de fósforo e obtenha os dados sobre a intensidade do sinal de cada ponto.

Tabela 1: Padrões quantitativos de DNA de plasmídeo de dot blot. São mostrados os volumes necessários de solução padrão de DNA de plasmídeo de 25 pg/μL e água ou TE para preparar padrões de DNA de plasmídeo por diluições seriais duplas (600 μL/tubo). Os números na coluna padrão de DNA do plasmídeo (0,039 a 5 ng) são a quantidade de DNA em 200 μL de cada solução padrão de DNA de plasmídeo.

Padrão de DNA de plasmídeo (ng)	Volumes (μL) de solução-padrão de ADN plasmidial de 25 pg/μL	Volumes (μL) de água	Volume total (μL)
5	600	0	600
2.5	300	300	600
1.25	150	450	600
0,625	75	525	600
0,313	37,5	562,5	600
0,156	18.8	581.2	600
0,078	9.4	590,6	600
0,039	4.7	595,3	600

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Benzonase	MilliporeSigma	1016970001	Referida como endonuclease de Serratia marcescen no texto principal.
DNase I	Roche	4716728001	Referido como DNase I Enzima A no texto principal.
DNase I	Invitrogen	18047019	Referido como DNase I Enzima B no texto principal.
DNase I	Biolabs da Nova Inglaterra	M0303L	Referido como DNase I Enzima C no texto principal.
Tubos de microcentrífuga com tampa de rosca O-Ring anexados de 1,5 mL	Corning	430909
Tubo cônico de polipropileno de 15 mL	Corning	352097
3 M Acetato de Sódio	Teknova	S0298
Tubo cônico de polipropileno de 50 mL	Corning	430291
Solução AccuGENE 0,5 M EDTA	Lonza	Rolamento 51234
AccuGENE 1 M Tris-HCl pH 8,0	Lonza	Rolamento 51238
AccuGENE 10% SDS	Lonza	Rolamento 51213
Tampão AccuGENE 1X TE	Lonza	Rolamento 51235
Aparelho Bio-Dot	Bio-Rad	1706545
Albumina de soro bovino	MilliporeSigma	Resposta 3294
Elevador de células	Corning	3008
clorofórmio	MilliporeSigma	372978
Kit extrator de DNA	Wako Pure Chemical Industries	295-50201	Isso é usado para manchas quantitativas em vírus purificados. Usamos apenas metade do volume de todos os reagentes em cada etapa recomendada para o Esquema de Protocolo 2 no manual fornecido pelo fabricante.
Etanol 200 Prova	Laboratórios Decon	2716
Ficoll 400	Alfa Aesar	B22095	Referido como Polissacarose 400.
glicogénio	Roche	10901393001
DNA de esperma de arenque	Invitrogen	15634-017
Tubos de hibridização	Thermo Fisher Científico	Telefone: 13-247-150
ImageQuant TL	Ciências da Vida da GE Healthcare	ImageQuant TL
Hexahidrato de Cloro de Magnésio	MilliporeSigma	M0250
de exposição de fosforimagem	Ciências da Vida da GE Healthcare	vário
Tela de fosforimagem	Ciências da Vida da GE Healthcare	vário
Kit Maxi de Plasmídeo	QIAGEN	Rolamento 12162
Polietilenomina	Policiências Inc	Rolamento 23966-2
Polivinilpirrolidona	MilliporeSigma	Pág. 5288
Solução de proteinase K	Invitrogen	Rolamento 25530-049
Enzimas de Restrição	Biolabs da Nova Inglaterra	vário
DNA de esperma de salmão	Invitrogen	15632011
Pipetas sorológicas	Thermo Fisher Científico	13-678-11D / 13-678-11E / 13-678-11
cloreto de sódio	Thermo Fisher Científico	S271-10
Citrato de sódio tribásico di-hidratado	MilliporeSigma	C8532
Base Tris	Thermo Fisher Científico	BP152-5
Tufão FLA 7000	Ciências da Vida da GE Healthcare	28955809
Fenol Saturado com Tampão UltraPuro	Invitrogen	15513-047
Reticulador UV	Espectrolina	XLE-1000	O modo de reticulação ideal é usado, fornecendo uma dosagem de energia UV de 120 mJ/cm2.
Membrana Zeta-Probe	Bio-Rad	162-0165