1. Preparação da amostra
- Leve 50 mg de tecido de camundongo para um tubo de 1,5 mL. Adicionar 200 μL de tampão de lise (50 mM HEPES, pH 7,4, 137 mM NaCl, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 1 mM MgCl2, 10 mM Na2P2O7, 1% Triton X-100, 10% de glicerol), suplementado com inibidores de protease e fosfatase (100 mM NaF, 0,1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonil, 5 μg/mL de pepstatina, 10 μg/mL de leupeptina, 5 μg/mL de aprotinina).
- Homogeneizar o tecido com um homogeneizador por 1 min no gelo.
- Centrifugue por 10 min a 8.000 x g a 4 °C.
- Colete o sobrenadante em novos tubos (1,5 mL) e retire 1 μL para o ensaio de concentração de proteína com um kit de BCA.
NOTA: Todos os tampões de lise comumente usados para análise de western blot e análise de dot blot podem ser usados para análise de QDB.
2. Determinando a especificidade do anticorpo
- Prepare lisados de amostra (20 μg) na seção 1.4, BSA livre de IgG (20 μg) e proteína padrão (600 pg), para análise de western blot.
NOTA: A BSA livre de IgG é usada como controle negativo e a proteína padrão é usada como controle positivo. A especificidade do anticorpo é demonstrada mostrando uma banda do tamanho certo usando a análise de western blot.
3. Definindo a faixa linear da análise QDB
- Dissolver a proteína-padrão com ddH2O. Diluir a proteína até uma concentração de 1.200 pg/μL.
- Diluir a proteína concentrada das amostras preparadas na secção 1.4 a 4 μg/μl.
- Diluir a proteína até uma concentração de 1.200 pg/μL e 4 μg/μL.
- Uma série de diluições de proteína padrão e amostras preparadas foram preparadas com a orientação da Tabela 1 e Tabela 2.
- Misture 10 μL de proteína padrão de diluição ou amostras preparadas por diluição e 10 μL de tampão de carga 2x (120mM Tris-HCl pH 6,8, 20% de glicerol, 4% de SDS, 0,2% de azul de bromfenol, 200 mM de DTT).
- Aquecer as misturas a 85 °C durante 5 min.
4. Processo de Análise de QDB
- Exemplo de aplicação
- Apoie a placa QDB para evitar que a parte inferior da placa toque na superfície da mesa. Por exemplo, use uma caixa de ponteira de pipeta vazia como suporte.
- Carregue até 2 μL da amostra no centro da membrana na parte inferior da unidade individual da placa QDB.
- Secando o prato
- Deixe a placa QDB carregada por 1 h em temperatura ambiente (RT) ou, como alternativa, deixe a placa carregada a 37 ° C por 15 min em um espaço bem ventilado.
- Bloqueando a placa
- Mergulhe a placa QDB no tampão de transferência (glicina 0.039 M, Tris 0.048 M, SDS 0.37%, álcool metílico 20%) e agite suavemente a placa por 10 s.
- Enxágue a placa QDB suavemente com TBST (solução salina tamponada com Tris, 0,1% Tween 20) três vezes e, em seguida, lave a placa por 5 min em TBST sob agitação constante.
- Bloqueie a placa QDB com tampão de bloqueio (5% de leite desnatado em TBST (100 μL / poço) por 1 h sob agitação constante.
- Incubação primária de anticorpos
- Dilua o anticorpo primário no tampão de bloqueio em uma concentração escolhida (de 1: 500 a 1: 5.000) e adicione 100 μL a cada poço individual de uma placa comum de 96 poços. Insira a placa QDB na placa de 96 poços e incube as placas combinadas por 2 h em RT ou durante a noite a 4 ° C sob agitação constante.
- Alternativamente, coloque a placa QDB dentro de uma caixa e encha a caixa com um tampão de bloqueio 2 a 3 mm acima da porção da membrana da placa se o mesmo anticorpo for usado para toda a placa. Adicionar o anticorpo primário à concentração escolhida e incubar a placa durante 2 h a RT ou durante a noite a 4 °C sob agitação constante.
- Enxágue a placa suavemente com TBST três vezes antes de ser lavada com TBST três vezes, cada vez por 5 min sob agitação constante.
- Incubação secundária de anticorpos
- Diluir o anticorpo secundário no tampão de bloqueio na concentração escolhida (de 1:1.000 a 1:50.000) e alíquota de 100 μL/poço em uma placa de 96 poços ou em uma caixa conforme descrito na seção 4.4.2 e, em seguida, incubar a placa QDB dentro da placa carregada de 96 poços ou da caixa por 1 h em RT sob agitação constante.
- Enxágue a placa QDB suavemente 3 vezes com TBST e, em seguida, lave a placa 3 vezes, 5 min cada com TBST sob agitação constante.
- Quantificação
- Prepare o substrato de quimioluminescência aprimorado (ECL) seguindo as instruções do fabricante.
- Alíquota do substrato ECL em uma placa de 96 poços (100 μL/poço) e insira a placa QDB dentro da placa de 96 poços por 2 min sob agitação constante.
- Remova a placa QDB da placa de 96 poços e agite brevemente para remover o excesso de líquido. Coloque a placa em uma placa de microtitulação branca.
- Ligue o leitor de microplacas e selecione "placa com tampa" na interface do usuário antes de colocar as placas combinadas (placa QDB + adaptador de placa branca) dentro do leitor de microplacas para quantificação.
NOTA: Certifique-se de usar a placa de microtitulação branca e não transparente como adaptador para evitar qualquer interferência da placa. Certifique-se de escolher "placa com tampa" para evitar emperrar a máquina quando placas combinadas (placa QDB + adaptador de placa de 96 poços) forem colocadas dentro do leitor de microplacas.
Tabela 1. Esquema de diluição para a curva de proteína padrão.
| S1
(0pg/μl) | S2 (33,3pg/μl) | S3
(100pg/μl) | S3
(300pg/μl) | S5
(600pg/μl) | S6
(1200pg/μl) |
| Proteína padrão (1200pg/μl) | 0 | 1,39 | 4.17 | 12.5 | 25 | 50 |
BSA
(4pg/μl) | 50 | 48.61 | 45.83 | 37,5 | 25 | 0 |
| total | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
Tabela 2. Esquema de diluição para amostras preparadas
| X1
(0μg/μl) | X2
(0,25μg/μl) | X3
(0,5μg/μl) | X4
(1μg/μl) | X5
(2μg/μl) | X6
(4 μg/μl) |
| Amostra (4μg/μl) | 0 | 3.125 | 6.25 | 12.5 | 25 | 50 |
| BSA livre de IgG (4μg/μl) | 50 | 46.875 | 43,75 | 37,5 | 25 | 0 |
| total | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 | 50 |
