NOTA: Este protocolo foi otimizado usando kits e reagentes padronizados e disponíveis comercialmente para aumentar a reprodutibilidade (consulte a Tabela de Materiais).
1. Preparação das amostras
- Extração de proteínas
- Transfira amostras de células ou tecidos congelados de -80 ° C em gelo seco, descongele no gelo e lave conforme necessário com solução salina tamponada com fosfato (PBS) gelada. Evite ciclos desnecessários de congelamento e descongelamento, pois isso afetará a qualidade da proteína.
- Adicione tampão de ensaio de radioimunoprecipitação (RIPA) (25 mM Tris-HCl (pH 7,6), 150 mM NaCl, 1% NP-40, 1% de desoxicolato de sódio, 0,1% SDS) contendo 1x inibidor de protease a cada amostra, usando a quantidade ideal por peso de tecido.
nota: Dependendo da aplicação, o tipo e a quantidade de buffer de homogeneização podem precisar de mais otimização.
- Use um homogeneizador elétrico portátil com um pilão de polipropileno para homogeneizar amostras de tecido. Entre cada amostra, lave o pilão em água bidestilada e seque-o com um lenço de papel limpo. Mude o pilão entre diferentes condições experimentais e tecidos.
- Deixe as amostras no gelo por 10 min após a homogeneização. Centrifugue as amostras a >10.000 x g a 4 °C por 10 min.
- Transferir o sobrenadante para um novo tubo sobre gelo sem perturbar o sedimento. O sobrenadante é a amostra de proteína. Armazenar a proteína extraída a -80 °C ou proceder diretamente à medição da concentração de proteína.
- Quantificação e normalização da concentração de proteínas
- Meça a concentração de proteína usando um ensaio de ácido bicinchonínico (BCA). Prepare uma mistura de ensaio de BCA de acordo com as instruções do fabricante em uma placa óptica de 96 poços usando 200 μL de mistura de BCA por poço.
nota: Outros métodos de quantificação, como os ensaios de Lowry e Bradford, também podem ser usados para determinar a concentração de proteínas, desde que a concentração de proteínas seja quantificada de forma consistente entre os experimentos.
- Preparar padrões de albumina de soro bovino (BSA) em concentrações crescentes em triplicata e adicionar 1 μL de cada amostra de proteína em duplicado. Incubar a placa de 96 poços em um bloco de calor pré-aquecido a 60 °C por 10 min ou mais, se a concentração de proteína for baixa.
- Após a incubação, medir a absorção a 560 nm utilizando um leitor de placas.
- Exporte as medições do leitor de placas e calcule a concentração de proteína comparando os valores médios de absorbância de cada amostra com uma curva padrão obtida usando o padrão de proteína. O valor do R-quadrado para a curva padrão deve ser maior ou igual a 0,98 para estimar com precisão a concentração de proteína da amostra.
- Normalize a quantidade de proteína preparando diluições de amostras de proteína em tampão de amostra e água ultrapura. O volume total pode ser ajustado dependendo do tipo de gel utilizado. Recomenda-se carregar 30 μg de proteína por pista como quantidade inicial. Adicionar um agente redutor, como o ditiotreitol (DTT; concentração final de 5 mM) ou o beta-mercaptoetanol (concentração final de 200 mM), a cada amostra, conforme necessário. Pipetar beta-mercaptoetanol não diluído numa hotte.
- Incube as amostras em um bloco de calor a 70 ° C por 10 min. Coloque as amostras no gelo, vórtice e gire brevemente para coletar. Mantenha no gelo até carregar o gel.
2. Eletroforese em gel de amostras de proteínas
- Configuração do dispositivo e do gel
- Configure um gel pré-moldado de gradiente Bis-Tris de 4 a 12% (consulte a Tabela de Materiais) no sistema de câmara de eletroforese em gel. Enxágue os géis com água bidestilada antes de usar.
NOTA: Dependendo do tamanho, interações e abundância da proteína de interesse, podem ser usados géis com um gradiente, agente tampão ou tamanho e número de poços diferentes.
- Adicione 500 mL de 1x tampão de corrida MES SDS diluído em água bidestilada por tanque. Remova cuidadosamente o pente dos géis depois de adicionar o tampão de corrida sem perturbar os poços no gel de empilhamento.
- Carga de proteínas
- Carregue 3,5 μL de um padrão de proteína no poço. Dependendo do layout da amostra, carregar uma escada de proteína em ambos os lados do gel pode ajudar a estimar com mais precisão o tamanho da proteína. Use pontas de carregamento de gel de ponta fina para um carregamento de amostra mais preciso.
- Ao usar um padrão interno para normalização entre membranas (consulte a etapa 5 abaixo e a discussão), carregue uma quantidade igual às outras amostras nos primeiros 3 poços próximos à escada de proteínas.
- Carregar 30 μg de cada amostra nos restantes alvéolos. Adicione 1x tampão de amostra a todos os poços vazios.
- eletroforese
- Monte o tanque de gel após carregar as amostras. Passe as amostras pelo gel de empilhamento a 80 V por 10 min, seguido de 150 V por mais 45-60 min.
3. Transferência de proteínas
NOTA: A transferência de proteínas neste protocolo é realizada usando um sistema de blotting semi-seco disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais) para resultados rápidos e consistentes.
- Prepare a transferência de proteína pré-embebendo papel de filtro em água bidestilada e garantindo que a faca de gel, a pipeta de plástico Pasteur, o rolo de mata-borrão e a pinça estejam prontos para uso.
- Abra a pilha de transferência removendo cuidadosamente toda a folha de embrulho. Remova a parte superior da pilha inferior e reserve. Umedeça rapidamente a membrana na pilha inferior com várias gotas de tampão de eletroforese (2-3 mL). Uma vez que a pilha de transferência esteja aberta, é importante evitar que a membrana de PVDF seque.
- Depois de parar a eletroforese, abra o gel pré-moldado usando a faca de gel e corte o gel de empilhamento. Corte o gel nas bordas para libertá-lo do molde de plástico. Mantenha a faca de gel molhada para evitar danos ao gel.
- Monte a pilha de transferência de baixo para cima: pilha inferior (contendo a membrana de PVDF), gel de proteína e papel de filtro. Use o rolo absorvente para remover todas as bolhas de ar. Coloque a pilha superior em cima do papel de filtro e role a pilha novamente para remover as bolhas de ar. Não empurre com muita força, pois isso pode fazer com que o gel se deforme durante a transferência de proteínas.
- Transfira toda a pilha para o dispositivo de transferência com o eletrodo no lado esquerdo do dispositivo e coloque a esponja de gel no topo da pilha de forma que fique alinhada com os contatos elétricos correspondentes no dispositivo. Feche a tampa, selecione e inicie o programa apropriado (20 V por 7 min é um ponto de partida recomendado).
- Quando terminar, deixe a tampa fechada por 2 min para permitir que a pilha esfrie e evite que a membrana seque. Remova a pilha de transferência e corte a membrana no tamanho do gel. Lave a membrana cortada rapidamente com água bidestilada antes de continuar com a mancha de proteína total.
4. Coloração total de proteínas
NOTA: O uso da detecção fluorescente oferece um benefício substancial em relação às abordagens mais tradicionais (por exemplo, detecção de ECL), pois a faixa linear e a sensibilidade podem ser muito melhor controladas. Portanto, nas etapas 4 e 5, são usados TPS fluorescentes e anticorpos secundários fluorescentes (consulte a Tabela de Materiais).
- Enrole a membrana em um tubo de 50 mL com o lado da proteína voltado para dentro. Devido à sensibilidade à luz do TPS fluorescente e dos anticorpos secundários, todas as etapas subsequentes são realizadas no escuro.
- Adicione 5 mL de solução de corante proteico (consulte a Tabela de Materiais) e incube em um rolo por 5 min em temperatura ambiente. Como o TPS e o tampão de lavagem contêm metanol, execute essas etapas em uma capela de exaustão.
- Descarte a solução de coloração e lave duas vezes rapidamente com 5 mL de solução de lavagem (ácido acético a 6,3% em metanol a 30%). Coloque o tubo brevemente de volta no rolo entre as etapas de lavagem. Enxágue a membrana brevemente com água ultrapura antes de continuar.
5. Bloqueio, incubação de anticorpos e detecção
- Bloqueando a membrana: Adicione 3 mL de tampão de bloqueio (consulte a Tabela de Materiais) ao tubo de 50 mL que contém a membrana. Incube a membrana em um rolo por 30 min em temperatura ambiente. Dependendo da escolha do anticorpo, o tipo de tampão de bloqueio usado pode exigir otimização.
- Incubação primária de anticorpos
- Descarte o tampão de bloqueio e substitua-o pelo anticorpo primário na concentração apropriada e otimizada (Figura 1 e Figura 2: camundongo-anti-SMN, a 1:1.000, diluído em tampão de bloqueio).
nota: A otimização adequada dos anticorpos primários deve incluir a confirmação de que o anticorpo detecta um produto proteico do tamanho certo, embora não mostre nenhuma ou mínima ligação a outros produtos proteicos inespecíficos. Se possível, teste e compare vários anticorpos com a proteína de interesse.
- Incubar a membrana num rolo durante a noite a 4 °C. No dia seguinte, retire a solução de anticorpos e lave-a 6 vezes por 5 min com 1x PBS em rolo à temperatura ambiente (RT).
- Incubação secundária de anticorpos
- Prepare o anticorpo secundário específico a 1:5.000 contra o hospedeiro do anticorpo primário em um tampão de bloqueio de 5 mL. Outros anticorpos secundários podem exigir outras diluições ou o uso de tampões de bloqueio alternativos.
- Incubar a membrana com a solução de anticorpos secundários num rolo durante 1 h à RT. Após a incubação, lave a membrana três vezes 30 min com 1x PBS em um rolo.
- Seque a membrana e mantenha-a protegida da luz usando papel alumínio até a detecção. As membranas podem ser mantidas a 4 °C para armazenamento a longo prazo.
- Aquisição de imagem
- Faça login no computador conectado ao scanner. Coloque a membrana no scanner com o lado da proteína voltado para baixo e selecione a área de digitalização no software.
- Otimize a intensidade do laser para ambos os canais (700 nm e 800 nm), confirmando que não ocorre saturação. Adquira as imagens em ambos os canais e exporte-as para análise posterior (etapa 6).
6. Análise e quantificação de Western blot
NOTA: Essas recomendações são baseadas no software Image Studio disponível gratuitamente. No entanto, análises comparáveis também podem ser feitas usando outros pacotes de software, como o ImageJ.
- Importar o arquivo: crie um espaço de trabalho local no computador usado para análise. Isso gera um banco de dados de arquivos de imagem para western blots adquiridos. Importe os arquivos obtidos no scanner e selecione a imagem para análise.
- Análise – TPS
- Exiba o canal de 700 nm para mostrar o resultado total da coloração de proteínas. Um exemplo de imagem TPS está incluído na Figura 1, na qual diferentes tecidos de camundongos neonatais (P5) (Figura 1A-B) e camundongos de 10 semanas (Figura 1C-D) são comparados diretamente. Da mesma forma, a Figura 2 mostra um exemplo de uma comparação direta do tecido cerebral de camundongos de diferentes idades.
- Selecione a guia Análise no canto superior direito e selecione Adicionar retângulo para definir a área de interesse para normalização (Figura 1B, D). Copie e cole a primeira área do retângulo em cada amostra individual para garantir que a região definida tenha o mesmo tamanho para todas as pistas analisadas.
- Copie o resultado da guia Formas no canto inferior esquerdo do software.
- Quantificação
nota: A abordagem ideal para quantificar amostras depende do desenho experimental. Forneceremos aqui um exemplo ilustrativo da detecção da proteína do neurônio motor de sobrevivência (Smn; uma proteína-chave envolvida na atrofia muscular espinhal da doença neuromuscular), que é conhecida por diminuir com o tempo, e como a normalização da intensidade do sinal Smn para TPS fornece estimativas confiáveis do desenvolvimento da expressão da proteína.
- A Figura 2 mostra uma diminuição da expressão de Smn com o aumento da idade do animal com TPS como controle de carga proteica. Repita as etapas 6.2.1-6.2.3 para quantificar a carga de proteínas (Figura 2B). Repita as etapas 6.2.1-6.2.3 no canal de 800 nm (Figura 2A) para analisar a proteína de interesse.
- Copie os resultados do TPS e da proteína de interesse para um programa de planilha. Na planilha, primeiro, normalize a carga de proteína determinando o sinal TPS mais alto e dividindo cada valor de sinal TPS por esse valor para obter o valor de carga de proteína normalizado.
- Divida o valor do sinal de 800 nm de cada amostra individual pelo valor da proteína normalizada correspondente para calcular a proporção relativa de expressão da proteína em diferentes amostras.
- Após a primeira normalização, compare vários pontos de tempo ou tecidos com o valor médio do padrão interno para permitir comparações diretas entre diferentes membranas e experimentos.
