1. Determinando a composição celular na suspensão celular usando análise de Western Blot de célula única (scWB)
- Reidrate o chip scWB antes de usar em 15 mL de tampão de suspensão 1x em uma placa de Petri por pelo menos 10 min em RT.
- Adicione 1 mL da suspensão diluída de célula única (10.000-100.000 células/mL) ao chip reidratado. Coloque a superfície no fundo de uma placa de Petri de 10 cm. Certifique-se de que a superfície esteja plana.
- Cubra a placa de Petri com uma tampa para evitar o ressecamento e deixe as células assentarem por 5-15 min por um gradiente.
- Coloque o chip sob um microscópio de campo claro e inspecione os poços com ampliação de 10x.
nota: Aproximadamente 15-20% dos micropoços devem ser ocupados por uma única célula, e menos de 2% dos poços devem conter 2 ou mais células.
- Incline a placa de Petri de 10 cm que contém o chip em 45 graus.
- Lave o chip com o buffer de suspensão 1x para remover as células não capturadas da superfície do chip pipetando suavemente de cima para baixo do chip. Repita 3 vezes.
- Prepare o instrumento ocidental de célula única.
- Defina o tempo de lise, o tempo de eletroforese e o tempo de captura de UV. Para analisar os macrófagos recrutados recuperados do tampão de gel derivado da membrana basal, use as seguintes configurações: tempo de lise: 0 s; tempo de eletroforese: 160 s; Tempo de captura UV 240 s.
- Carregue cuidadosamente o chip na célula de eletroforese do instrumento ocidental de célula única, voltado para o lado do gel. Tenha cuidado para não danificar o lado do gel do chip.
- Despeje a lise/tampão de corrida na câmara e cubra completamente todo o chip Western de célula única. Inicie a lise celular.
- Execute o instrumento scWB usando a configuração listada em 1.8.
- Quando a execução estiver concluída, transfira o chip para uma placa de Petri de 10 cm e lave o chip duas vezes com 1x tampão de lavagem por 10 min em RT.
- Prepare diluições de anticorpo primário (anti-vinculina: 1:10; anti-CD45: 1:15, anti-CD11b: 1:20, anti-F4 / 80: 1:10) em um volume total de 80 μL de diluente de anticorpo (misture 8 μL de anticorpo 1 mais 8 μL de anticorpo 2 mais 64 μL de diluente).
- Adicione 80 μL da solução de anticorpo primário à câmara de sondagem de anticorpos e abaixe o chip com o lado do gel para baixo para que a solução de anticorpos seja absorvida pelo chip.
- Incubar com a solução de anticorpos primários durante 2 h à RT.
- Lave o cavaco três vezes por 10 min em 1x tampão de lavagem no shaker.
- Lave o chip uma vez por 10 min na água do shaker para dessalinizar o gel.
- Preparar uma diluição de 1:20 de anticorpo secundário num volume total de 80 μL (misturar 2 μL de anticorpo secundário mais 78 μL de diluente).
- Incubar a pastilha com um anticorpo secundário durante 1 h a RT protegido da luz.
- Lave o cavaco três vezes por 10 min com 1x tampão de lavagem no shaker.
- Gire o chip usando um girador de slides para remover qualquer tampão de lavagem restante.
- Digitalize o chip em um scanner de microarray de laser duplo com resolução de 5 μm no canal espectral do fluoróforo acoplado aos anticorpos secundários.
- Analise os dados usando um software específico do scWB.
2. Removendo o chip scWB
- Armazene o chip digitalizado em um tampão de lavagem até que esteja pronto para descascar.
- Coloque o banho-maria em uma hotte.
- Coloque um suporte para tubos de 50 mL no banho-maria com a água apenas 1 cm acima do suporte e ajuste a temperatura da água para 60 °C.
- Prepare o tampão de decapagem. Para 1 L de solução tampão de decapagem, dissolver 9,85 g de Tris-HCl (pH 6,8) e 20 g de SDS em 900 mL de água destilada e ajustar o pH. Em seguida, encha com água destilada a 1L. Adicione 0,8% (v/v) de β-mercaptoetanol (β-ME; 14,3 M) imediatamente antes de cada uso.
- Após a varredura inicial, coloque o chip em uma placa de Petri de 10 cm antes de descascar.
- Para cada chip, pegue 40 mL de tampão de decapagem e adicione 320 μl de β-ME.
CUIDADO: β-ME é tóxico e perigoso para os seres humanos e para o meio ambiente. O procedimento a seguir deve ser feito em uma capela de exaustão.
- Coloque o chip no recipiente e sele-o com parafilme para evitar que a água vaze para dentro do recipiente
- Coloque o recipiente dentro do suporte para tubos no banho-maria pré-aquecido.
- Incubar por 90 min.
- Remova cuidadosamente o chip do recipiente e coloque-o em uma placa de Petri fresca.
- Lave brevemente o chip uma vez com 1x tampão de lavagem. Em seguida, adicione 15 mL de 1x tampão de lavagem à placa de Petri.
- Lave o chip por 15 min em uma coqueteleira. Repita a etapa de lavagem quatro vezes.
nota: O chip está pronto para o próximo anticorpo primário (consulte as etapas 1.12 a 1.21)
