Ensaio de Western Blot Quimioluminescente para Processamento de Proteínas

Resumo

Fonte: Hillert-Richter, L. K. et al., Medindo a Composição do Complexo de Sinalização Indutor de Morte CD95 e Processamento de Procaspase-8 neste Complexo. J. Vis. Exp. (2021).

Este vídeo descreve o western blotting baseado em quimioluminescência de lisados imunoprecipitados. A técnica ajuda a determinar o processamento e a ativação de proteínas. O sinal quimioluminescente detectado é proporcional ao nível de processamento da proteína durante sua ativação.

Protocolo

experimentos com células T foram realizados de acordo com o acordo ético 42502-2-1273 Uni MD.

1. Preparando células para o experimento

NOTA: O número médio de células para esta imunoprecipitação é de 1 × 10⁷. As células aderentes devem ser semeadas um dia antes do experimento, de modo que haja 1 × 10⁷ células no dia do experimento.

1. Preparando células aderentes para o experimento
   1. Semeie 5-8 × 10⁶ células aderentes em 20 mL de meio (consulte a Tabela de Materiais para a composição) para cada condição em placas de 14,5 cm um dia antes do início do experimento.
   2. No dia do experimento, certifique-se de que as células sejam 80-90% confluentes e aderentes ao prato. Descarte o meio e adicione meio fresco às células aderentes.
2. Preparando células em suspensão para o experimento
   1. Coloque cuidadosamente 1 × 10⁷ células em suspensão em 10 mL de meio de cultura (consulte a Tabela de Materiais para a composição) por condição em placas de 14,5 cm imediatamente antes do início do experimento.
   2. Se estiver usando células primárias, isole as células T primárias de acordo com o procedimento descrito anteriormente. Trate as células T primárias com 1 μg / mL de fitohemaglutinina por 24 h, seguido de tratamento com 25 U / mL de IL2 por 6 dias.
   3. Coloque cuidadosamente 1 × 10⁸ células T primárias em 10 mL de meio de cultura (consulte a Tabela de Materiais para a composição) por condição em placas de 14,5 cm imediatamente antes do início do experimento.
      nota: Esse número maior de células T primárias é recomendado, pois essas células são menores.

2. Estimulação CD95L

1. Estimular as células com CD95L (produzido conforme descrito anteriormente ou comercialmente disponível (ver Tabela de Materiais).
   nota: A concentração do CD95L e o tempo de estimulação dependem do tipo de célula. Prepare uma condição de estimulação duas vezes para gerar uma amostra de 'controle de contas' em paralelo.
   1. Estimule as células aderentes com a concentração selecionada de CD95L. Segure a placa em ângulo e pipete o ligante no meio sem tocar nas células aderentes.
   2. Estimule as células em suspensão com CD95L pipetando a solução ligante na suspensão celular.

3. Colheita de células e lise

1. Coloque os pratos de células no gelo.
   nota: Não descarte o meio. As células moribundas flutuam no meio e são importantes para a análise.
2. Adicione 10 mL de solução salina tamponada com fosfato frio (PBS) à suspensão celular e raspe as células anexadas da placa. Recolha a suspensão celular em um tubo de 50 mL.
3. Lave o prato celular com 10 mL de PBS frio duas vezes e coloque a solução de lavagem no mesmo tubo de 50 mL. Centrifugar a suspensão celular a 500 × g durante 5 min, 4 °C.
4. Descarte o sobrenadante e ressuspenda o pellet celular com 1 mL de PBS frio. Transfira a suspensão celular para um tubo de 1,5 mL.
5. Centrifugar a suspensão celular a 500 × g durante 5 min, 4 °C. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular com 1 ml de PBS frio.
6. Centrifugue a suspensão celular a 500 × g durante 5 min, 4 °C. Rejeitar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular com 1 ml de tampão de lise (contendo 4% de cocktail inibidor da protease). Incube por 30 min no gelo.
7. Centrifugue o lisado na velocidade máxima (~ 17.000 × g) por 15 min, 4 ° C.
8. Transfira o sobrenadante (lisado) para um tubo limpo. Descarte o pellet. Tomar 50 μL do lisado noutro tubo. Analise a concentração de proteína pelo ensaio de Bradford e tome a quantidade de lisado correspondente a 25 μg de proteína em um frasco. Adicione o buffer de carregamento (consulte a Tabela de Materiais para a composição) ao frasco. Armazene-o a -20 °C como controle de lisado.

4. Imunoprecipitação (IP)

1. Adicione 2 μL de anticorpos anti-APO-1 e 10 μL de esferas de sepharose de proteína A (preparadas conforme recomendado pelo fabricante) ao lisado. Adicione apenas 10 μL dos grânulos a um tubo separado contendo lisado (amostra estimulada) para gerar um 'controle de grânulos'
   nota: Use pontas de pipeta com orifícios largos cortando as pontas ou comprando pontas especiais para IP ao manusear as esferas de sepharose da proteína A.
2. Incubar a mistura de lisado com anticorpos/esferas de sepharose de proteína A com mistura suave durante a noite a 4 °C. Centrifugar os lisados com anticorpos/esferas de sepharose de proteína A a 500 × g durante 4 min, 4 °C. Rejeitar o sobrenadante, adicionar 1 ml de PBS frio às esferas e repetir este passo pelo menos três vezes.
3. Descarte o sobrenadante. Aspire as esferas de preferência com uma seringa Hamilton de 50 μL.

5. Western blot

1. Adicione 20 μL de tampão de carga 4x (consulte a Tabela de Materiais para a composição) aos grânulos e aqueça a 95 °C por 10 min. Aqueça os controles de lisado a 95 °C por 5 min.
2. Carregue os lisados, IPs e um padrão de proteína em um gel de dodecil sulfato de sódio (SDS) a 12,5% (consulte a Tabela de Materiais para a preparação do gel) e opere com uma tensão constante de 80 V.
3. Transferir as proteínas do gel SDS para uma membrana de nitrocelulose.
   nota: Aqui, a técnica semi-seca, otimizada para as proteínas de interesse, foi utilizada para a transferência ao longo de 12 min (25 V; 2,5 A = constante). Mergulhe a membrana de nitrocelulose e duas pilhas de transferência de tamanho pequeno em tampão de eletroforese (consulte a Tabela de Materiais para a composição, prepare de acordo com as instruções do fabricante) por alguns minutos antes do western blotting.
4. Coloque a membrana borrada em uma caixa e bloqueie-a por 1 h em uma solução de bloqueio (0,1% Tween-20 em PBS (PBST) + 5% de leite). Incubar a membrana com a solução de bloqueio sob agitação suave.
5. Lave a membrana três vezes com PBST por 5 min a cada lavagem.

6. Detecção de Western blot

1. Adicionar o primeiro anticorpo primário à membrana na diluição indicada (ver Tabela de Materiais) e incubá-lo durante a noite a 4 °C com agitação suave.
2. Lave a membrana três vezes com PBST por 5 min a cada lavagem.
3. Incubar a membrana com 20 mL de anticorpo secundário (diluído 1:10.000 em PBST + 5% de leite) com agitação suave por 1 h em temperatura ambiente.
4. Lave a membrana três vezes com PBST por 5 min a cada lavagem.
5. Descarte o PBST e adicione aproximadamente 1 mL de substrato de peroxidase de rábano à membrana.
6. Detecte o sinal quimioluminescente (ver Tabela de Materiais).
   nota: O tempo de exposição e o número de imagens capturadas dependem da quantidade de proteína na célula e da especificidade dos anticorpos utilizados. Deve ser estabelecido empiricamente para cada anticorpo utilizado para a detecção.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
12,5% de gel SDS	Feito por você mesmo		Para dois géis de separação: 3,28 mL de H2O destilado 2,5 mL de Tris; pH 8,8; 1,5 M 4,06 mL de acrilamida 100 μL 10% SDS 100 μL 10% APS 7,5 μL TEMED para dois géis coletores: 3,1 mL de H2O destilado 1,25 mL de Tris; pH 6,8; 1,5 M 0,5 mL de acrilamida 50 μL 10% SDS 25 μL 10% APS 7,5 μL TEMED
Pratos de células de 14,5 cm	Greiner	Nº 639160
acrilamida	Carl Roth	Resposta A124.1
Pontas de pipeta de filtro de aerossol com filtro de alta recuperação e orifício largo	VWR	46620-664 (América do Norte) ou 732-0559 (Europa)	Usado para pipetar grânulos para o lisado
Usado para pipetar grânulos para o lisado	Sigma Aldrich	Rolamento A2103	Diluição: 1:4000 em PBST + 1:100 NaN3
Ab anti-APO-1	Fornecido nesses experimentos pelo Prof. P. Krammer ou pode ser adquirido pela ENZO	ALX-805-038-C100	Usado apenas para imunoprecipitação
anti-caspase-10 Ab	Biozol	MBL-M059-3	Diluição: 1:1000 em PBST + 1:100 NaN3
anti-caspase-3 Ab	Sinalização celular	9662 S	Diluição: 1:2000 em PBST + 1:100 NaN3
anti-caspase-8 Ab C15	Fornecido nesses experimentos pelo Prof. P. Krammer ou pode ser adquirido pela ENZO	ALX-804-242-C100	Diluição: 1:20 em PBST + 1:100 NaN3
Ab anti-CD95	Santa Cruz	SC-715	Diluição: 1:2000 em PBST + 1:100 NaN3
anti-c-FLIP NF6 Ab	Fornecido nesses experimentos pelo Prof. P. Krammer ou pode ser adquirido pela ENZO	ALX-804-961-0100	Diluição: 1:10 em PBST + 1:100 NaN3
anti-FADD 1C4 Ab	Fornecido nesses experimentos pelo Prof. P. Krammer ou pode ser adquirido pela ENZO	ADI-AAM-212-E	Diluição: 1:10 em PBST + 1:100 NaN3
Ab anti-PARP	Sinalização celular	Pedido 9542	Diluição: 1:1000 em PBST + 1:100 NaN3
Aps	Carl Roth	9592.3
β-mercaptoetanol	Carl Roth	4227.2
Solução Bradford Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml	Bio Rad	500-0006	Usado de acordo com as instruções do fabricante
CD95L	Fornecido nesses experimentos pelo Prof. P. Krammer ou pode ser adquirido pela ENZO	ALX-522-020-C005
Detector de quimioluminescência Chem Doc XRS+	Bio Rad
Coquetel Completo de Inibidores de Protease (PIC)	Sigma Aldrich	ALX-522-020-C005	Preparado de acordo com as instruções do fabricante
DPBS (10x) sem Ca, Mg	PAN Biotech	Pág. 04-53500	Diluição 1:10 com H2O, armazenamento na geladeira
Tampão de eletroforese	Feito por você mesmo		Tampão de eletroforese 10x: 60,6 g Tris 288 g glicina 20 g SDS e 2 L H2O diluição 1:10 antes do uso
glicina	Carl Roth	3908.3
Cabra Anti-Rato IgG1 HRP	Biotecnologia do Sul	1070-05	Diluição 1:10.000 em PBST + 5% de leite
Cabra Anti-Rato IgG2b HRP	Biotecnologia do Sul	1090-05	Diluição 1:10.000 em PBST + 5% de leite
IgG-HRP anti-coelho caprino	Biotecnologia do Sul	Nº 4030-05	Diluição 1:10.000 em PBST + 5% de leite
Interleucina-2 Humana (hIL-2)	Merckgroup/ Roche	11011456001	Para ativação de células T
Kcl	Carl Roth	Nº 6781.2
KH2PO4	Carl Roth	3904.1
Tampão de carga 4x Tampão de amostra Laemmli, 10 mL	Bio Rad	161-0747	Preparado de acordo com as instruções do fabricante
Substrato Luminata Forte Western HRP	Millipore	WBLUFO500
Tampão de lise	Feito por você mesmo		13,3 mL Tris-HCl; pH 7,4; 1,5 M 27,5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 adicionar 960 mL H2O
Meio para células aderentes DMEM F12 (1:1) com glutamina estável, 2.438 g/L	PAN Biotech	Pág. 04-41154	Adicionando 10% FCS, 1% de Penicilina-Estreptomicina e 0,0001% de Puromicina ao meio
Meio para células T primárias	gibco por Life Technologie	21875034	Adicionando 10% FCS e 1% de penicilina-estreptomicina ao meio
Leite em pó	Carl Roth	T145.4
Na2HPO4	Carl Roth	Pág. 030.3
NaCl	Carl Roth	3957.2
PBST	Feito por você mesmo		20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56,8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 Copyright © 2021 JoVE Journal of Visualized Experiments jove.com Página 3 de 3 20 mL Tween-20 ad 2 L Diluição de H2O 1:20 antes do uso
PBST + 5% de leite	Feito por você mesmo		50 g de leite em pó + 1 L de PBST
Pha	Thermo Fisher Científico	R30852801	Para ativação de células T
Poder Pac HC	Bio Rad
Precision Plus Protein Standard All Blue	Bio Rad	161-0373	Use entre 3-5 μL
Grânulos de proteína A Sepharose CL-4B	Novodirect/ Th.Geyer	GE 17-0780-01	Contas de resina Affinity preparadas de acordo com as instruções do fabricante
raspador	VWR	Rolamento 734-2602
Sds	Carl Roth	4360.2
shaker	Heidolph
Azida de sódio	Carl Roth	K305.1
TEMED	Carl Roth	2367,3
Pilhas de transferência de tamanho mini Trans Blot Turbo	Bio Rad	170-4270	Usado de acordo com as instruções do fabricante
Buffer de transferência TransBlot Turbo 5x	Bio Rad	10026938	Preparado de acordo com as instruções do fabricante
Membrana de nictrocelulose TransBlot Turbo Mini-size	Bio Rad	170-4270	Usado de acordo com as instruções do fabricante
Trans-Blot-Turbo	Bio Rad
Tris	Soluto Químico	8,08,51,000
Tritão X-100	Carl Roth	3051.4
Interpolação-20	Pan Reac Appli Chem	A4974,1000