Southern Blotting para detectar recombinação homóloga no genoma de células-tronco embrionárias de camundongos

Resumo

Fonte: Li, J., et al. Identificação de eventos de recombinação homóloga em células-tronco embrionárias de camundongo usando Southern blotting e reação em cadeia da polimerase. J. Vis. Exp. (2018).

Neste vídeo, descrevemos a técnica de Southern blotting para identificar eventos de recombinação homóloga no genoma de células-tronco embrionárias de camundongos usando sondas radiomarcadas. As regiões de DNA contendo eventos de recombinação homóloga aparecem como bandas distintas quando a membrana contendo o DNA ligado à sonda é exposta a raios-X.

Protocolo

1. Preparação de DNAs genômicos e digestão com enzima(s) de restrição

1. Prepare gDNAs a partir de células-tronco embrionárias (células ES) usando um kit comercial (kit de purificação de DNA genômico) com pequenas modificações.
   1. Remova o meio da cultura de células ES e adicione 500 μL de solução de lise de núcleos, incluindo RNaseA, diretamente nos poços para lisar as células.
      nota: O lisado celular pode ser armazenado a -80 °C ou tratado imediatamente.
   2. Pipet para cima e para baixo várias vezes para lisar as células completamente e transferi-las para um tubo limpo de 1,5 mL.
   3. Adicione um terço do volume da solução de precipitação de proteínas ao tubo de 1,5 ml, vore vigorosamente durante 20 s, refrigere as amostras em gelo durante 5 min e, em seguida, centrifugue a uma força de 2.000 x g durante 5 min. Transfira o sobrenadante para outro tubo limpo de 1,5 ml contendo um volume igual de isopropanol; misture suavemente a solução. (Observe que fios brancos semelhantes a fios podem ser vistos neste momento.) Centrifugue a uma força de 2.000 x g por 1 min; então, descarte o sobrenadante.
   4. Lave o gDNA pellet com 1 mL de etanol a 70% à temperatura ambiente, centrifugue a uma força de 2.000 x g por 1 min, aspire o sobrenadante cuidadosamente e, em seguida, seque ao ar o gDNA pellet por 3 min.
   5. Dissolver os gADNs com 100 μl de solução de reidratação do ADN e, em seguida, incubar a 65 °C durante 1 h ou a 4 °C durante a noite.
   6. Armazenar os gDNAs a 2–8 °C.
2. Digerir os gDNAs com RE Dra I pré-projetado. Estabeleça uma reação de digestão de 30 μL misturando 3 μL de tampão 10x para Dra I, 3 μL de Dra I, 10 μg de gDNAs/amostra e H₂O até 30 μL e incube a 37 °C durante a noite.
3. Verifique a integridade da digestão pelo gel de DNA, analisando 5 μL da reação digerida e, em seguida, adicione os 3 μL de tampão de carga de DNA 10x para a etapa subsequente.

2. Southern Blotting

1. Triagem Southern blotting
   1. Separe os gDNAs digeridos por eletroforese e transfira-os para uma membrana.
      1. Prepare um gel de eletroforese de agarose a 1% com brometo de etídio (EB), carregue as amostras de gDNA digeridas e uma escada de 1 kb e execute o gel com baixa voltagem (30–40 V) durante a noite.
      2. Retire o gel e tire uma foto com um sistema de imagem de gel de DNA após a eletroforese. Verifique se os gDNAs digeridos e separados exibem uma imagem semelhante a esfregaço.
      3. Mergulhe o gel em uma bandeja com solução de HCl 0,2 N e agite suavemente por 20 min em temperatura ambiente.
      4. Transfira o gel para uma solução desnaturante de DNA e agite-o suavemente por 20 min em temperatura ambiente.
      5. Troque o gel por uma solução neutralizadora de DNA e agite-o suavemente por 20 min em temperatura ambiente.
         nota: O gel é propenso a quebrar após esta etapa, por isso deve ser manuseado com cuidado.
      6. Use o sistema de transferência rápida para baixo para transferir os DNAs do gel para a membrana. Monte o TurboBlotter e a pilha de borrões de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante.
         NOTA: A solução de citrato de sódio (SSC) 10x ou 20x é usada como tampão de transferência. Em geral, 3 h de transferência são suficientes para transferir 95% dos gDNAs do gel para a membrana; no entanto, um tempo mais longo de transferência é inócuo.
      7. Retire a membrana e lave-a com 2x SSC por 1 min, absorva o líquido com os tecidos e, em seguida, reticule o DNA com a membrana usando um reticulador UV.
         nota: A membrana pode ser armazenada a 4 °C durante uma semana.
2. Rotule as sondas de DNA com radioatividade.
   1. Purifique os plasmídeos da sonda usando um kit miniprep de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante.
   2. Liberar os fragmentos de DNA das sondas do vetor plasmidial por digestão EcoR I em uma solução de reação incluindo 5 μL de tampão para EcoR I, 2 μL de enzima EcoR I, 20 μg de DNA de plasmídeo e H₂O até 50 μL, por 2 h.
   3. Execute um gel de DNA a 1% para separar os fragmentos de DNA da sonda do vetor e purifique os fragmentos de DNA das sondas com um kit de extração de gel de DNA de acordo com o protocolo fornecido pelo fabricante.
   4. Medir, utilizando 1 μl da solução de ADN, a concentração de ADN dos fragmentos de ADN da sonda com um espectrofotómetro no comprimento de onda de 260/280 nm.
   5. Prepare 40 ng de DNAs de sonda em um tubo de 1,5 mL com 45 μL de tampão TE, ferva por 3 min, gire brevemente e, em seguida, coloque o (s) tubo (s) no gelo por 2 min.
   6. Adicione os DNAs de sonda desnaturados por calor ao tubo contendo grânulos de marcação de DNA prontos para uso (-dCTP), pipete para cima e para baixo para misturar, adicione 5 μL de [α³²P]dCTP e, em seguida, incube a 37 ° C por 15 min.
   7. Purifique as sondas marcadas usando microcolunas G-50 de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante e, em seguida, meça a radioatividade com um contador de cintilação (opcional).
3. Hibridize a(s) membrana(s) com as sondas rotuladas.
   1. Pré-hibridizar a membrana.
      1. Pré-aqueça a solução de hibridização a 42 °C por 30 min. Misture 20 mL de solução de hibridização pré-aquecida com 200 μg de DNA de esperma de salmão fervido em um tubo de 50 mL.
      2. Coloque a membrana no tubo de hibridização. Adicione a solução mista de pré-hibridização ao tubo de hibridização. Coloque-o no forno de hibridização (ajuste o rolamento e a temperatura em 42 °C) e deixe a pré-hibridização prosseguir por 30 min.
   2. Hibridizar a membrana com a(s) sonda(s) marcada(s).
      1. Retirar o tubo de hibridização e deitar a solução de pré-hibridização num tubo de 50 ml; adicionar a sonda desnaturada (aquecida a 100 °C durante 3 min) do passo 2.1.2.7 a este tubo e misturar suavemente.
         nota: Reduza quaisquer bolhas indutoras.
      2. Retorne a solução misturada ao tubo de hibridização e execute a hibridização a 42 °C durante a noite.
4. Lave a(s) membrana(s) para remover as sondas não hibridizadas.
   1. Coloque a(s) membrana(s) em uma bandeja com 1x SSC + 0.1% SDS e agite suavemente a 55–60 °C por 10 min.
   2. Transfira a(s) membrana(s) para uma bandeja com 0,5x SSC + 0,1% SDS e agite suavemente a 55–60 °C por 10 min.
   3. Verifique a radioatividade na(s) membrana(s) usando um contador Geiger portátil para decidir se uma terceira lavagem é necessária.
5. Exponha a radioatividade na membrana a filmes de raios-X.
   1. Remova o líquido da(s) membrana(s) lavada(s).
   2. Envolva a(s) membrana(s) com filme plástico e fixe-a(s) no de exposição.
   3. Exponha a membrana a duas folhas de filme de raios-X em uma sala escura.
   4. Coloque o de exposição a -80 °C durante a noite ou mais.
6. Revele os filmes para visualizar os resultados. Avalie se um clone ES correspondente é o desejado com a recombinação direcionada ou não, de acordo com os tamanhos das bandas de DNA detectadas pelas sondas.
7. Reinhibridize a mesma membrana com outra sonda depois de retirar a sonda usada de acordo com o seguinte procedimento: retire a membrana usada, lave-a 1x com H₂O limpo e, em seguida, incube-a em solução de marcação (55% formamida, 2% SSPE, 1% SDS, H₂O) a 65 ° C com agitação suave por 1–2 h.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit de extração de gel QIAquick	QIAGEN	Rolamento 28704
Solução de desnaturação de DNA	VWR	351-013-131
Solução neutralizante de DNA	VWR	351-014-131
EcoR I	Thermo Científico	ER0271
Dra I	Thermo Científico	ER0221
Micro Colunas ProbeQuan G-50	GE Saúde	28-9034-08
Solução de hibridização Hybrisol I	Millipore	S4040
Grânulos de rotulagem de DNA prontos para uso (-dCTP)	VWR	27-9240-01
UltraPure SSC, 20x	Thermo Fisher	15557036
Solução de DNA de esperma de salmão	Thermo Fisher	15632011
Sistema de Transferência TurboBlotter Whatman, Kits Grandes	Fisher Científico	09-301-188
[α32P] dCTP	PerkinElmer	NEG013H100UC
Filme de raio-X Kodak	Z&Z Medical	844 5702
Kit Miniprep QIAprep Spin	QIAGEN	Rolamento 27104
Solução de lise de núcleos	Promega	Resposta 7941
Solução de precipitação de proteínas	Promega	A7951