Northern blot para detectar e quantificar microRNA específico no extrato total de RNA do tecido vegetal

Resumo

Fonte: Tirumalai, V., et al. Análise de manchas de RNA para a detecção e quantificação de microRNAs vegetais. J. Vis. Exp. (2020)

Neste vídeo, demonstramos o northern blot, uma técnica de hibridização para detectar e quantificar microRNAs (miRNAs) do RNA total extraído do tecido vegetal.

Protocolo

1. Eletroforese em gel

1. Pare a pré-corrida e lave os poços antes do carregamento da amostra.
2. Aqueça as amostras a 98 °C por 1 min e carregue as amostras quentes no poço usando pontas capilares. Insira a ponta no fundo do poço de modo que a amostra ocupe uma camada fina no poço.
3. Carregamento completo de todas as amostras. Inclua o carregamento do marcador de década de RNA.
4. Execute o gel a 80 V até que o corante azul de bromofenol escorra quase completamente. O azul de bromofenol funciona a 10 pb em um gel de acrilamida desnaturante a 15%.

2. Preparação para electroblotting

1. Corte a membrana N + nylon nas dimensões de uma placa de vidro e rotule a membrana no canto superior direito com um lápis HB.
2. Coloque suavemente a membrana na superfície da água estéril, voltada para o lado rotulado em direção à superfície da água. Mergulhe previamente a membrana por 15 min.
3. Corte 4 pedaços de papel mata-borrão I nas dimensões de uma almofada de fibra.
4. Prepare o sanduíche de gel colocando o lado cinza do em uma bandeja limpa.
5. Molhe previamente a almofada de fibra e coloque-a sobre o. Remova as bolhas de ar.
6. Molhe previamente um pedaço de papel mata-borrão em 1x TBE e coloque-o sobre a almofada de fibra. Remova as bolhas de ar rolando uma pipeta de plástico sobre o papel. Coloque outro pedaço de papel absorvente pré-úmido e remova as bolhas de ar.
7. Remova cuidadosamente o gel do em execução e coloque-o sobre a configuração do sanduíche, de modo que a primeira amostra de RNA carregada fique à direita.
8. Mergulhe suavemente a membrana pré-embebida em 1x TBE e coloque-a sobre o gel, voltada para o lado rotulado para baixo. Estenda para remover as bolhas de ar.
9. Mergulhe um pedaço de papel mata-borrão, coloque-o sobre a membrana e remova as bolhas de ar. Mergulhe outro pedaço de papel mata-borrão, coloque-o sobre a configuração do sanduíche e remova as bolhas de ar.
10. Complete o sanduíche colocando uma almofada de fibra pré-úmida sobre a configuração e fechando firmemente o.
11. Coloque o transblot no módulo e preencha 1x TBE, pH 8.2, até a marca de borrão.
12. Transferir a 10 V, durante a noite a 4 °C.
13. Após a transferência, coloque a membrana úmida em uma folha de papel e imediatamente reticule o RNA à membrana por irradiação com luz UV de 254 nm (120.000 μjoules/cm²). A mancha reticulada pode ser armazenada a 4 °C para hibridização adicional.

3. Preparação da sonda radiomarcada

1. Projete uma sonda que seja completamente complementar ao pequeno RNA a ser detectado.
2. Finalize a sonda usando ƳP32ATP (obtido do BRIT) em sua extremidade 5', combinando os componentes de acordo com a receita fornecida na Tabela 1.
3. Incubar a mistura de reação acima referida a 37 °C durante 30 min.
4. Separe o ƳP32ATP não rotulado da sonda usando uma coluna Sephadex G-25 de acordo com o protocolo do fabricante.

4.Hibridização da mancha

1. Coloque a mancha de ligação cruzada, com o lado do RNA voltado para o topo, dentro de um frasco de hibridização.
2. Misture vigorosamente o tampão de hibridização ultrassensível, adicione 10 mL dele e incube a mancha dentro de um forno de hibridização mantido a 35 ° C, com rotação.
3. Realize a pré-hibridização por 20 min.
4. Retire a garrafa do forno e adicione suavemente a sonda rotulada no tampão de hibridização.
5. Hibridizar a mancha a 35 °C, com rotação durante 12 h.
6. Após a hibridização, transfira cuidadosamente a solução de hibridização para um tubo de 15 mL. Esta solução pode ser conservada a 4 °C até ser reutilizada.
7. Realize uma lavagem rápida do blot por 2 min para remover o excesso de solução de hibridização adicionando 2x tampão SSC mais 0,5% SDS. Descarte a solução.
8. Incubar o blot com 2x tampão SSC mais 0,5% SDS por 35 °C, com rotação por 30 min.
9. Lave o borrão novamente com tampão SSC 0,5x mais 0,5% SDS por 35°C, com rotação por 30 min.
10. Coloque a mancha dentro de uma tampa de hibridização, remova o excesso de tampão e feche-a.
11. Exponha-o a uma tela de gerador de imagens de fósforo livre de radiação durante a noite dentro de um.
12. Detecte o sinal de hibridização usando um gerador de imagens biomolecular e analise os resultados usando um software adequado.

Tabela 1: Tabela de Receitas

Tampão e solução	receita	Comentários
10 x TBE	Buffer Tris de 0,89 M	pH deve ser ajustado para 8.2 usando ácido acético
	0,89 M de ácido bórico
	30mM EDTA
Mistura de gel	15% de acrilamida-bissacrilamida sol, 19:1	A mistura de gel não deve conter cristais de ureia
	8M ureia
	1X TBE
Corante de carregamento de gel	0,05% (p/v) de azul de bromofenol	Deve-se tomar cuidado ao manusear a formamida deionizada
	0,05% (p/v) Xileno xyanol
	100 % formamida deionizada
Rotulagem da sonda	Tampão PNK (10X, 2 μL)	Esta mistura contém moléculas radioativas, esta etapa deve ser realizada por pessoal treinado dentro de um laboratório radioativo
	Enzima PNK (1 μL)
	Oligo (100 μM, 0,1 μL)
	ƳP32 ATP (4 μL)
Tampão de lavagem - I	2X SSC
	0,5% (p/v) SDS
Tampão de lavagem - II	0,5X SSC
	0,5% (p/v) SDS
Buffer de remoção - I	0,5X SSC
	0,1% (p/v) SDS
Buffer de remoção - II	0,1X SSC
	0,1% (p/v) SDS

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução de acrilamida-bisacrilamida a 40%	sigma	Resposta 9926	químico
Persulfato de amônio (APS)	BioRad	Rolamento 1610700	químico
mata-borrão	O que é papel mata-borrão I	1001-125	Análise
Azul de bromofenol	sigma	B5525-5G	químico
Pontas de carga capilar	BioRad	2239915	Artigos de plástico
Formamida deionizada	Ambion	AM9342	químico
Bloco de aquecimento	Eppendorf	5350	dispositivo
Membrana Hybond N+nylon	Ge	RPN203B	Análise
Frasco de hibridização	sigma	Z374792-1EA	Artigos de plástico
Forno de hibridização	Thermo Científico	1211V79	dispositivo
N,N,N',N'- Tetrametiletilenodiamina (TEMED)	sigma	T7024-25ml	químico
Fósforo	Scanner GE- Typhoon	29187194	dispositivo
Tela e PhosphorImager	GE Healthcare	GE28-9564-75	dispositivo
Pipetas	Gilson, modelos: P20 e P10	FA10002M, FA10003M	Artigos de plástico
Pipeta em material plástico	falcão	Rolamento 357550	Artigos de plástico
Aparelho de gel de poliacrilamida	BioRad	1658003EDU	dispositivo
Coluna Sephadex G-25	GE Healthcare	27532501	dispositivo
Concentrador de velocidade Vac	Thermo Científico	Telefone: 20-548-130	dispositivo
Vitória giratória	Tarsons	1010	dispositivo
Polinucleotídeo quinase T4 (PNK)	Neb	M0201S	Análise
Aparelho de transblot	BioRad	1703946	dispositivo
Tampão de hibridização ULTRAHyb	Ambion	AM8670	Análise
ureia	Fischer Scientific	15985	químico
Reticulador UV	UVP	CL-1000L	dispositivo
vórtice	Tarsons	3020	dispositivo
Banho-maria	NEOLAB	D-8810	dispositivo
Xileno cianol	sigma	X4126-10G	Análise