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NOTA: As proteínas recombinantes usadas neste estudo, Hsp90 e Cdc37, foram obtidas comercialmente (ver Tabela de Materiais).
1. Ativação do chip
NOTA: Todos os materiais a serem usados no experimento estão listados na Tabela de Materiais. Filtrar todas as soluções preparadas através de um filtro estéril de 0,2 μm.
- Prepare a solução de 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil) carbodiimida (EDC) adicionando 2 mg de EDC a 2,5 mL de tampão 1 M de ácido 2-(N-morfolino) etano sulfônico (MES) (pH = 6,0) em um tubo de 15 mL. Prepare soluções de N-hidroxisulfosuccinimida (sulfo-NHS) adicionando 6 mg de sulfo-NHS a 2,5 mL de tampão MES 1 M (pH = 6,0) em um tubo separado de 15 mL. Alíquota 50 μL de cada solução em tubos independentes e armazene a -20 ° C para uso futuro.
- Misture volumes iguais de EDC e solução de sulfo-NHS (50 μL de EDC + 50 μL de sulfo-NHS) pipetando para cima e para baixo (não vórtice).
NOTA: A solução mista de EDC/sulfo-NHS deve ser usada dentro de 30 min para manter a reticulação eficaz para a funcionalização adequada do chip.
- Coloque o chip do biossensor (5.7 cm x 2.4 cm; consulte a Tabela de Materiais) fornecido pela empresa em uma placa de Petri de vidro com tampa encaixada. Sugere-se que todas as etapas de funcionalização envolvidas na ativação do chip sejam feitas dentro da placa de Petri. Aplique 50 μL de tampão MES 1 M (pH = 6,0) no chip do biossensor, incube por 1 min em temperatura ambiente e, em seguida, aspire o tampão.
- Aplique 50 μL de solução EDC/sulfo-NHS imediatamente no chip do sensor. Cubra a placa de Petri e incube por 15 min em temperatura ambiente. Aspire a solução de EDC / sulfo-NHS do chip.
- Enxágue o chip uma vez com 50 μL de tampão MES 1 M (pH = 6,0); aspire o tampão MES.
2. Imobilização da proteína-alvo
- Enxágue o chip 2x com 50 μL de 1x PBS (pH = 7,4). Aspire o PBS do chip e adicione a molécula alvo, Hsp90 (50 μL; 500 nM).
NOTA: A incompatibilidade de buffer pode arruinar todo o experimento; portanto, antes do experimento, é importante certificar-se de que a molécula-alvo esteja no mesmo tampão usado para calibração (por exemplo, 1x PBS (pH = 7,4)). Se necessário, realize uma troca de tampão por diálise noturna antes do experimento. Neste experimento, a diálise noturna foi realizada para ambas as proteínas recombinantes, Hsp90 e Cdc37, contra 1x PBS (pH = 7,4; ver Tabela de Materiais) com troca de tampão adequada a 4 ° C. A concentração do material alvo (Hsp90 neste caso) pode variar de acordo com diferentes protocolos experimentais e a natureza dos materiais alvo (proteínas/peptídeos/ligantes).
- Cubra a placa de Petri de vidro e incube por 30 min em temperatura ambiente. Aspirar a solução que contém a molécula-alvo e enxaguar 3x com 50 μL de PBS 1x (pH = 7,4). Aspire a solução 1x PBS (pH = 7,4) do chip.
- Adicione 50 μL de Quench 1 (3,9 mM de álcool amino-PEG5 em 1x PBS (pH = 7,4)) solução ao chip. Cubra a placa de Petri de vidro e incube por 15 min em temperatura ambiente. Aspire a solução Quench 1 do chip.
- Adicione 50 μL de solução Quench 2 (1 M etanolamina (pH = 8,5)) ao chip. Cubra a placa de Petri de vidro e incube por 15 min em temperatura ambiente. Aspire a solução de Quench 2 do chip e enxágue o chip 5x usando 50 μL de 1x PBS, deixando a última gota de PBS no sensor.
3. Preparação de amostras de analitos
- Preparar séries de diluição da substância a analisar para Cdc37 no intervalo de concentração desejado. Para o primeiro experimento, foram utilizadas as seguintes concentrações: 25 nM, 50 nM, 100 nM, 200 nM, 400 nM, 800 nM, 1.000 nM, 2.000 nM, 3.000 nM e 5.000 nM. Para o segundo experimento, foi utilizado um conjunto diferente de concentrações variando de 0,4 nM a 200 nM.
- Conceber a experiência de modo a incluir pelo menos oito concentrações diferentes de analitos para obter um valor de KD fiável. Preparar as diferentes diluições da proteína da substância a analisar no mesmo tampão que o utilizado para a calibração e a proteína-alvo; aqui é 1x PBS (pH = 7,4).
4. Carregamento do chip biossensor ativado no dispositivo FEB
NOTA: O dispositivo FEB consiste em um leitor com indicações de luz LED e um cartucho para inserir o chip do biossensor.
- Após a imobilização da proteína alvo, insira o chip ativado no cartucho do dispositivo, que é conectado via USB a um computador. Após a inserção do chip, uma luz LED verde será exibida no leitor indicando que o dispositivo FEB está pronto para o experimento. Instale o software automatizado (consulte Tabela de Materiais) fornecido pela empresa no computador, ao qual o dispositivo FEB está conectado, para monitorar o experimento passo a passo, conforme descrito abaixo.
5. Executar o experimento
- Pressione o módulo Run Experiment no software automatizado e escolha 10 pontos com regeneração ou qualquer outro protocolo desejado. Preencha os seguintes dados: nome do operador, nome do experimento, data (por exemplo, Yana, Hsp90 + Cdc37, 14.03.2021); buffer de regeneração (por exemplo, buffer PBS); o alvo imobilizado (por exemplo, Hsp90); analito em solução (por exemplo, Cdc37).
- Pressione o botão Iniciar o experimento exibido no software e siga as instruções mostradas pelo software automatizado, conforme descrito abaixo.
nota: O software é totalmente automatizado, fácil de usar e orienta o usuário durante todo o experimento passo a passo. Uma janela pop-up aparecerá na tela com instruções para prosseguir em cada etapa do experimento. O software fornecerá instruções para cada etapa repetitiva consecutivamente desde calibração, associação de analitos, dissociação, regeneração e lavagem (5x) para cada concentração de analito ao longo do experimento.
- Execute a calibração do instrumento. Para isso, aspire a solução de PBS restante do chip e aplique 50 μL de tampão de calibração (1x PBS; pH = 7,4). Pressione o botão Continuar e aguarde 5 minutos até que a etapa de calibração seja concluída. O software exibe o ponto final determinado para a etapa de calibração (5 min) com um alarme de aviso para acompanhamento.
- Em seguida, execute uma associação de analitos. Para isso, aspirar o tampão de calibração do chip e aplicar 50 μL da concentração mais baixa do analito (25 nM de Cdc37). Pressione o botão Continuar e aguarde 5 minutos até que a etapa de associação seja concluída. O software exibe o ponto final para a etapa de associação (5 min) com um alarme de aviso para prosseguir.
- Efectuar uma dissociação da substância a analisar. Para isso, aspirar a solução analita do chip e aplicar 50 μL do tampão de dissociação (1x PBS; pH = 7,4). Pressione o botão Continuar e aguarde 5 minutos até que a duração da etapa de dissociação (5 minutos) termine. O software exibe o ponto final para a etapa de dissociação (5 min) com um alarme de aviso para acompanhamento.
- Em seguida, execute a regeneração do chip. Aspirar a solução de dissociação da pastilha e aplicar 50 μL de tampão de regeneração (1x PBS; pH = 7,4). Pressione o botão Continuar e aguarde 30 s até que a duração da etapa de regeneração (30 s) termine. O software exibe o ponto final para a etapa de regeneração (30 s) com um alarme de aviso para acompanhamento.
- Por fim, lave o chip. Aspire a solução de regeneração do chip e aplique 50 μL de tampão de lavagem (1x PBS; pH = 7,4) no chip. Aspire a solução do chip e repita isso 5x. Deixe a última gota de tampão de lavagem no cavaco, pressione o botão Continuar e aguarde 30 s até que a duração da etapa de lavagem termine no visor do software.
NOTA: O software exibe o ponto final da etapa de lavagem (30 s) com um alarme de aviso para prosseguir com o próximo ciclo do experimento.
- Repetir os passos para cada concentração da substância a analisar utilizada; as cinco fases de calibração, associação da substância a analisar, dissociação, regeneração e lavagem (5x) constituem um ciclo. Para o experimento mostrado aqui, realizamos 10 ciclos para 10 concentrações de analitos (variando de 25 nM a 5.000 nM ou 0,4 nM a 200 nM; Figura 1).
