Técnicas de Detecção de Interação Biomolecular

Neste vídeo, descrevemos a tecnologia de biossensoriamento de efeito de campo (FEB) para detectar e quantificar as interações proteína-proteína. As proteínas-alvo imobilizadas no biossensor de grafeno interagem com as proteínas analitas em solução, resultando em alterações de corrente elétrica no sistema FEB. Essa mudança na resposta elétrica indica a afinidade de ligação entre as proteínas.

Neste vídeo, demonstramos o uso da fotometria de massa para estudar as interações antígeno-anticorpo em uma câmara de fluxo. A luz focalizada se espalha de forma diferente com base na massa das moléculas. Um detector coleta a luz espalhada e gera o padrão de interferência como pontos de intensidades variadas, que se correlacionam com as massas moleculares.

O vídeo descreve a técnica de imagem FLIM-FRET para determinar a interação proteína-proteína em bactérias vivas que expressam proteínas citoplasmáticas marcadas com proteínas fluorescentes, um doador eGFP e um aceptor mCherry. A técnica combinada também permite a quantificação das proteínas que interagem.

Neste vídeo, demonstramos a técnica para medir as interações transcelulares entre moléculas de adesão celular sináptica por meio do ensaio de agregação de células HEK. Neste ensaio, um número igual de células HEK expressando uma molécula de adesão celular pré-sináptica desejada e uma proteína fluorescente são misturadas com células HEK expressando uma molécula de adesão celular pós-sináptica e outra proteína fluorescente. A interação entre as moléculas de adesão celular força as células a se...

Este vídeo descreve o ensaio de ligação de proximidade para estudar as interações proteína-proteína in situ em células de nematóides. A proximidade das proteínas de interesse gera o molde circular de DNA com a ajuda de uma sonda PLA ligada a um anticorpo secundário. A sonda é ainda amplificada usando a solução de amplificação, que produz um DNA longo de fita simples seguido pela hibridização da sonda detectora, permitindo a localização de interações proteína-proteína nas células.

Este vídeo demonstra complexos proteicos co-imunoprecipitados em uma membrana de PVDF para análise de interação proteína-proteína. As proteínas reduzidas dos complexos foram tratadas com tripsina para clivar as proteínas individuais nos peptídeos menores e, em seguida, os peptídeos restantes foram extraídos da membrana do PVDF. O peptídeo puxado derivado de ambas as proteínas do complexo foi então seco e ressuspenso em baixa concentração de ácido fórmico para posterior análise.

Neste vídeo, demonstramos a tecnologia de interferometria de biocamada (BLI) para detectar as interações intermoleculares entre ligantes e analitos alvo em tempo real. O BLI mede as mudanças no padrão de interferência da luz branca refletida por uma camada de ligantes imobilizados na superfície de um biossensor à medida que interagem com os analitos em solução.

Este vídeo demonstra o uso da espectroscopia de flutuação de fluorescência para detectar a interação entre as proteínas da superfície celular nos contatos célula-célula. Ao expressar o receptor de adesão transmembrana de interesse marcado com uma proteína fluorescente e misturar duas populações de células diferentes que abrigam dois marcadores fluorescentes separados espectralmente, a transinteração entre os receptores de duas células vizinhas com fluorescência de cores diferentes é avaliada...

Neste vídeo, demonstramos uma técnica para realizar a co-imunoprecipitação de proteínas PD-1 do tipo selvagem e mutantes marcadas com GFP usando esferas revestidas com anticorpos anti-GFP. As proteínas PD-1-GFP ligadas a grânulos são incubadas com proteínas SHP2 que interagem com PD-1, permitindo a identificação de motivos estruturais específicos em PD-1 que desempenham um papel crítico na interação SHP2.

Este vídeo descreve uma técnica baseada em ELISA que detecta interações proteína-proteína entre duas proteínas, medindo a ligação da segunda proteína à primeira proteína imobilizada. A segunda proteína ligada é detectada usando anticorpos específicos marcados com uma enzima, como a peroxidase de rábano.

Este vídeo demonstra um ensaio de biossensor condutimétrico para estudar a interação de um anticorpo com um antígeno alvo imobilizado em um chip transdutor. O biossensor é projetado para ter uma proteína quimérica bifuncional - uma enzima β-lactamase com um sítio catalítico funcional fundido a um nanocorpo para se ligar ao antígeno alvo imobilizado. Após a ligação, a hidrólise catalítica de um substrato antibiótico pela enzima β-lactamase gera um sinal elétrico - confirmando a interação...

Este vídeo demonstra uma técnica que usa peptídeos de penetração de células biotiniladas para detectar interações proteína-proteína intracelular. Os peptídeos que penetram nas células facilitam a entrada do peptídeo conjugado em uma célula e se ligam especificamente às suas proteínas de interação. A biotina, após se ligar à avidina, permite a purificação do complexo de proteínas que interagem a partir de um lisado celular.

Este vídeo demonstra o ensaio de dois híbridos de levedura para detectar autointerações proteicas específicas. Neste ensaio, a proteína de interesse é marcada em dois domínios de um fator de transcrição que codifica a enzima β-galactosidase. Quando as duas proteínas interagem, isso causa transcrição e tradução para formar a enzima, que é então detectada usando um ensaio bioquímico.

Este vídeo demonstra a purificação de afinidade em tandem - uma técnica para purificar complexos de proteínas de células eucarióticas para estudar a interação proteína-proteína. O complexo contém duas proteínas marcadas com diferentes tags de epítopos. Após a purificação do complexo usando duas resinas com afinidade pelas duas marcas diferentes de maneira sequencial, a presença de ambas as proteínas no eluidor confirma a interação entre as duas.

Este vídeo descreve a técnica de ressonância plasmônica de superfície, ou SPR, para estudar a interação entre duas moléculas usando um chip sensor. A mudança no ângulo de ressonância e a intensidade da luz refletida são detectadas em função da associação e dissociação de duas moléculas, e isso fornece informações sobre as interações entre as duas moléculas.

Este vídeo descreve a técnica de espectroscopia de ressonância magnética nuclear para estudar as interações proteína-proteína entre 15proteínas envoplakin mutantes e do tipo selvagem marcadas com N e a proteína vimentina não marcada. A interação bem-sucedida entre a envoplaquina do tipo selvagem e a vimentina leva a um extenso alargamento da linha e ao desaparecimento do pico nos espectros de RMN, enquanto a ausência de uma interação entre a envoplaquina mutada e a vimentina resulta em picos...

Neste vídeo, demonstramos a técnica de exibição de fagos para isolar fagos pré-projetados que expressam proteínas com alta afinidade com a proteína-alvo.

Este vídeo demonstra a técnica de espectroscopia de flutuação de fluorescência (FFS) para estudar a homo-oligomerização de proteínas. As proteínas marcadas com fluorescência em uma amostra são dimerizadas usando um agente ao estudar a oligomerização de proteínas usando FFS. Usando um microscópio confocal, à medida que as proteínas se movem para dentro e para fora do pequeno volume de observação, a análise das flutuações no brilho das moléculas fluorescentes é realizada para determinar o estado...

Este vídeo descreve o BiFC-PALM ― uma combinação de microscopia de localização fotoativada e complementação de fluorescência bimolecular ― para avaliar as interações proteína-proteína. BiFC envolve a fusão de dois fragmentos de proteína fluorescente com duas proteínas de interesse que interagem. Quando as duas proteínas interagem, os fragmentos são aproximados, o que permite que as duas partes se juntem e reconstituam uma proteína fluorescente funcional. A fluorescência de um único fluoróforo é...

Neste vídeo, descrevemos a técnica de anisotropia de fluorescência para estudar as interações entre a proteína da síndrome de Shwachman-diamante marcada com fluoróforo (SBDS) e a 1 GTPase semelhante ao fator de alongamento (EFL1). Na incubação de proteínas SBDS com concentrações gradualmente crescentes de EFL1, observa-se um aumento constante na anisotropia, indicando uma interação bem-sucedida entre as duas proteínas.

Neste vídeo, demonstramos a técnica de espectroscopia de ressonância magnética nuclear na célula para estudar as interações proteína-ligante entre proteínas superexpressas não marcadas e pequenas moléculas. A interação ligante-proteína bem-sucedida é confirmada visualmente pelo aparecimento de um conjunto adicional de picos na região espectral de interesse que substitui gradualmente os picos originais.

Este vídeo demonstra um método para estudar as interações proteína-droga usando biopanning baseado em biossensor QCM da biblioteca de peptídeos T7 exibida por fago. O biopanning de fagos exibindo um peptídeo específico no biossensor QCM permite o isolamento específico de peptídeos de alta afinidade, seguido pelo sequenciamento de aminoácidos, que ajuda a identificar locais de interação específicos na proteína alvo.

Este vídeo descreve o SEC-MALS, que aproveita as habilidades da cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) e do espalhamento de luz multiangular (MALS). No SEC-MALS, o SEC separa proteínas ou complexos de proteínas com base em seu tamanho, e o detector MALS determina o peso molecular médio medindo a intensidade da luz espalhada pela molécula em diferentes ângulos.

Neste vídeo, demonstramos a purificação de afinidade de complementação bimolecular, BiCAP, para detectar e isolar dímeros de proteínas específicos usando anticorpos de domínio único específicos de conformação.

Neste vídeo, descrevemos um ensaio de ligação competitiva baseado em citometria de fluxo para detectar as interações entre o CXC Chemokine Receptor 4 (CXCR4) e seu ligante natural marcado com fluorescência CXC Chemokine Ligand 12 (CXCL12), na presença de uma pequena molécula direcionada a CXCR4. A incubação de células que expressam CXCR4 com concentrações mais baixas de moléculas pequenas permite a ligação CXCR4-CXCL12 até certo ponto, que diminui progressivamente com um aumento gradual nas...

Este vídeo demonstra a detecção baseada em ensaio repórter da interação receptor-ligante. A interação receptor-ligante bem-sucedida ativa a via de sinalização a jusante, causando a geração e liberação de citocinas como moléculas repórter secretoras na solução, o que é confirmado usando ELISA.

Neste vídeo, as sondas de força de biomembrana (BFPs) são usadas para medir as forças entre receptores e ligantes. Essa técnica pode detectar interações monitorando a pressão necessária para quebrar as ligações entre o pMHC conjugado nos grânulos da sonda e os TCRs nas células-alvo.

Este vídeo demonstra um ensaio de competição para estudar parceiros de proteínas de ligação à GTPase. Utilizando a proteína GTPase ligada a nucleotídeos imobilizada em esferas magnéticas, a ligação competitiva entre dois parceiros de proteína que interagem para o mesmo local de ligação na GTPase pode ser estudada para avaliar as afinidades de ligação dos parceiros de proteína.

Neste vídeo, demonstramos o processo de detecção de isotipos de anticorpos em várias amostras de soro humano usando uma lâmina de microarray impressa com subtipos antigênicos de cepas do vírus influenza.

Neste vídeo, demonstramos o ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforética para detectar interações proteína-DNA usando sondas de DNA marcadas com fluorescência infravermelha. Quando a proteína se liga à sonda de DNA, ela forma um grande complexo que migra lentamente e aparece como uma banda deslocada no gel.

Neste vídeo, demonstramos a técnica de imunoprecipitação da cromatina para identificar locais de ligação a proteínas em regiões específicas do DNA genômico de células precursoras de oligodendrócitos por meio da imunoprecipitação seletiva de fragmentos de cromatina ligados a proteínas. Este método ajuda a estudar a interação de várias proteínas reguladoras, incluindo fatores de transcrição envolvidos na regulação gênica.

Este vídeo descreve a anisotropia de fluorescência de alto desempenho que ajuda a monitorar a interação entre os fatores de transcrição e o DNA. O ensaio monitora as interações de uma molécula de DNA marcada com fluoróforo com seu fator de transcrição específico, medindo o grau de polarização devido à rotação molecular ou anisotropia do DNA marcado com fluoróforo.

Este vídeo demonstra um ensaio in vivo em bactérias para estudar a interação de proteínas de ligação a RNA (RBPs) com RNA. As células bacterianas são transformadas com duas construções de plasmídeo - um plasmídeo de sítio de ligação que codifica um mRNA contendo um gene repórter fluorescente a jusante de um sítio de ligação de RBP - enquanto um plasmídeo RBP expressa as proteínas RBP sob o controle de um indutor. Após o aumento mediado por indutor na produção de RBP, os RBPs se ligam ao mRNA,...

Neste vídeo, demonstramos o ensaio de um híbrido de levedura modificado, que detecta várias proteínas interagindo com o DNA alvo. As células de levedura transformadas contêm a sequência de DNA alvo a montante do gene repórter. Além disso, eles expressam proteínas do fator de transcrição. Quando as proteínas formam complexos e se ligam ao DNA alvo, o gene repórter é expresso e pode ser detectado enzimaticamente.

Neste vídeo, demonstramos o procedimento para determinar a atividade helicase de uma proteína-alvo para desenrolar o substrato dsRNA marcado com biotina. A atividade da enzima foi identificada pela análise do deslocamento da mobilidade eletroforética, seguida por um ensaio de quimioluminescência usando estreptavidina conjugada com enzima quimioluminescente.

Neste vídeo, descrevemos o método de imunofluorescência para visualizar a localização das proteínas de reparo de DNA γH2AX e 53BP1 nos locais de quebras de DNA de fita dupla em núcleos de células irradiadas.

Este vídeo demonstra um ensaio de extração de RNA in vitro para identificar proteínas de ligação a RNA (RBPs), que interagem com as sequências de elementos ricos em adenilato-uridilato (ARE) no mRNA. Os RBPs alvo de um lisado celular são misturados com uma sonda de RNA para formar complexos de RNA-proteína. Os complexos são isolados por purificação de afinidade utilizando a afinidade do marcador de destiobietina da sonda de RNA a um grânulo magnético marcado com estreptavidina.

Neste vídeo, descrevemos a evolução sistemática de ligantes pelo método de enriquecimento exponencial (SELEX) para identificar sequências específicas de ligação a RNA para uma proteína-alvo de interesse. A proteína é incubada com um grande conjunto de sequências de RNA aleatórias, e as sequências de RNA de ligação à proteína são isoladas, amplificadas por PCR e sequenciadas para identificar seus locais de ligação à proteína.

Este vídeo descreve um método para visualizar a montagem de condensados de proteínas de fusão em moléculas de DNA em loci específicos usando imagens de molécula única. Esses condensados são formados devido às interações LCD-LCD e LCD-DBD, que permitem o recrutamento da RNA polimerase II e o aumento da transcrição gênica.

Este vídeo demonstra a calorimetria exploratória diferencial — uma técnica para estudar a interação entre uma biomolécula e um ligante. A ligação de um aptâmero de DNA e um ligante termolábil é estudada aplicando ciclos repetidos de aquecimento e resfriamento à amostra e obtendo varreduras para análise termodinâmica.

Este vídeo demonstra a termoforese em microescala para estudar a interação proteína-lipídio. O ensaio detecta a interação entre as moléculas quantificando o movimento termoforético de proteínas marcadas com fluorescência em resposta a um gradiente de temperatura. A molécula fluorescente é misturada com diferentes concentrações das moléculas lipídicas não fluorescentes, e a mistura de moléculas na solução é carregada nos capilares. Um gradiente de temperatura é aplicado às amostras nos capilares...

Neste vídeo, demonstramos a interação entre proteínas e vesículas fosfolipídicas artificiais usando citometria de fluxo quantitativa. A ligação de proteínas marcadas com fluorescência a vesículas fosfolipídicas marcadas com fluorescência aumenta a intensidade média de fluorescência, e esse aumento é detectado por um citômetro de fluxo.

Este vídeo demonstra uma técnica de microgravimetria dissipativa para investigar a ligação de proteínas a bicamadas lipídicas. Pequenas vesículas unilamelares são adicionadas para revestir a superfície do sensor de quartzo de uma microbalança. Utilizando a ligação dependente de íons cálcio da proteína alvo de ligação a fosfolipídios à bicamada, as mudanças na frequência de oscilação do sensor e a dissipação da oscilação são monitoradas para determinar a natureza da ligação da bicamada...

Neste vídeo, demonstramos as interações proteína-fosfoinositídeo em um padrão microfluídico usando o ensaio de modulação de pH, usando corante fluorescente sensível ao pH marcado com lipídio fosfatidiletanolamina de uma bicamada lipídica suportada, chamada de plataforma microfluídica. As modulações no pH após a ligação da proteína ao fosfolipídio causam extinção de fluorescência.