1. Preparar as câmaras de fluxo
- Limpe as lamínulas de vidro
- Usando frascos de lavagem com água destilada, etanol e isopropanol, enxágue as lamínulas de 24 mm x 50 mm na seguinte ordem: água, etanol, água, isopropanol, água. Seque as lamínulas com uma corrente de nitrogênio limpo. É importante enxaguar as lamínulas de cima para baixo, segurando o canto inferior com uma pinça de ponta macia. Seque a lamínula na mesma direção para evitar a transferência de contaminação da pinça (Figura 1A).
- Da mesma forma, enxágue as lamínulas de 24 mm x 24 mm com água destilada, etanol e água destilada. Seque as lamínulas com uma corrente de nitrogênio limpo.
- Identifique o lado de trabalho da lamínula, coloque uma gota de água destilada na superfície da lamínula limpa e siga as etapas 3.1 a 3.2 do protocolo. Normalmente, apenas um lado da lamínula de 24 mm x 50 mm tem a qualidade óptica adequada para medições de MP.
nota: Após a focagem, nenhuma imperfeição significativa da superfície deve ser detectável e o valor do "sinal" mostrado no software de coleta de dados deve ser inferior a 0,05% (Figura 2A-C). Os lados de trabalho de todas as lamínulas na caixa são orientados na mesma direção. O mesmo procedimento deve ser usado para testar a eficiência da limpeza da lamínula.
- Monte a câmara de fluxo
- Posicione a lamínula de 24 mm x 24 mm em um pedaço de papel alumínio. Coloque tiras de fita dupla-face em cima da lamínula de 24 mm x 24 mm, conforme mostrado na Figura 1B, e corte a fita ao longo da borda do vidro. Separe a lamínula da folha de alumínio e prenda-a no lado de trabalho da lamínula de 24 mm x 50 mm (Figura 1C).
nota: O tamanho do canal pode variar, mas recomenda-se uma largura de 3 mm a 5 mm. Canais mais largos requerem volumes de amostra maiores e canais muito estreitos podem ser difíceis de carregar. Normalmente, dois canais paralelos podem ser facilmente criados na lamínula de 24 mm x 24 mm. O protocolo pode ser pausado aqui.
2. Preparar as amostras anticorpo-antigénio para as medições de afinidade
- Filtre pelo menos 2 mL do tampão PBS usando filtros de seringa de 0,22 μm para remover partículas de poeira ou agregados. Centrifugue o estoque de proteínas por 10 minutos na velocidade máxima da centrífuga de mesa (aproximadamente 16.000 x g).
nota: O PBS é o tampão recomendado para este protocolo, mas o MP não tem requisitos específicos de tampão, e outros tampões biológicos também são aceitáveis. No entanto, altas concentrações de glicerol (>10%) e intensidades iônicas muito baixas (concentração de sal <10 mM) podem afetar a qualidade da imagem e dos dados e não são recomendadas.
- Determinar as concentrações reais dos estoques de anticorpos e antígenos medindo sua absorvância UV de 280 nm.
- Calcular as concentrações medidas da mistura antigénio-anticorpo. Se o valor estimado da afinidade de ligação ao anticorpo não for conhecido, planeje preparar uma amostra com 30 nM de antígeno e 20 nM de concentração de anticorpos. Quando a afinidade aproximada é conhecida, a relação anticorpo/antígeno e suas concentrações devem ser otimizadas de acordo com os valores esperados de Kd. Utilizar a concentração total de antigénios na mistura igual à soma dos Kd esperados e da concentração total de anticorpos na equação seguinte. Supondo que Kd1 = Kd2 para os dois paratopos do anticorpo, isso resultará em concentrações comparáveis do anticorpo livre e dos complexos anticorpo-antígeno na amostra.
Ajuste a concentração de anticorpos para manter a concentração total de proteína na amostra dentro da faixa de 10 nM e 50 nM. Os melhores resultados são obtidos usando misturas com concentrações de anticorpos entre 5 nM e 25 nM.
nota: O MP detecta proteínas com massa molecular maior que 40 kDa. Consequentemente, as concentrações de amostras de antígenos com massa molecular menor que 40 kDa podem exceder o limite típico de 50 nM. No entanto, em concentrações superiores a aproximadamente 100 nM, mesmo antígenos de baixa massa molecular podem afetar a qualidade da imagem e a precisão da determinação de Kd.
- Preparar 50 μl da mistura anticorpo-antigénio na concentração final de medição calculada no passo 2.3.
nota: Apenas uma amostra da mistura antígeno-anticorpo é necessária para a determinação de Kd. No entanto, preparar várias amostras com diferentes proporções de antígeno para anticorpo pode ajudar a otimizar a concentração da amostra. Se os dados de várias amostras forem coletados, eles poderão ser analisados por meio de um ajuste global.
- Incubar a(s) mistura(s) antígeno-anticorpo por aproximadamente 10 min à temperatura ambiente para permitir que a reação de ligação atinja o equilíbrio químico. Evite tempos de incubação desnecessariamente longos.
nota: O tempo de incubação pode variar dependendo da cinética de ligação. Para confirmar que o equilíbrio químico foi alcançado, as medições da amostra podem ser repetidas em diferentes tempos de incubação. Os valores de Kd invariantes no tempo indicam incubação suficientemente longa. A incubação prolongada pode levar a uma adsorção significativa de proteínas na superfície do material de laboratório de plástico e, consequentemente, a erros significativos na determinação da concentração de proteínas. Por esse motivo, o material de laboratório de baixa adesão é fortemente recomendado para a preparação de amostras MP.
3. Coletar os dados de fotometria de massa
- Aplique uma gota de óleo de imersão no microscópio na objetiva do instrumento MP e coloque a câmara de fluxo montada no microscópio stage. Certifique-se de que o óleo cubra o espaço entre a lamínula e a objetiva.
- Carregue a câmara de fluxo e focalize o fotômetro de massa.
- Depositar 10 μL de uma solução tampão limpa e filtrada em uma extremidade do canal da câmara de fluxo preparado na etapa 1. O líquido entrará no canal por ação capilar.
- Ajuste a posição Z da platina para focar o microscópio na superfície de trabalho da lamínula de 24 x 50 mm.
- Na guia Controle de foco do software de coleta de dados, use os botões Up e Down de movimento grosseiro do stage para fazer os ajustes iniciais.
- Clique no botão Nitidez para mostrar a leitura do sinal de nitidez e use os botões de ajuste fino para cima e para baixo para maximizar o valor de nitidez.
- Clique nos botões Definir foco e Bloquear foco para ativar a função de rastreamento de foco. Uma imagem com foco adequado (Figura 2A, C) deve ter um valor de "sinal" abaixo de 0,05%.
nota: Se o valor do "sinal" na posição de nitidez máxima estiver acima de 0,05%, isso pode indicar impurezas na superfície do vidro ou no buffer.
- Usando o mesmo canal, carregue 20 μL da amostra anticorpo-antígeno depositando-a em um lado do canal e enxugando o líquido da outra extremidade com um pequeno pedaço de papel mata-borrão (Figura 1D).
nota: O volume de um canal de 3 a 5 mm de largura é de aproximadamente 10 μL. O volume de amostra adicional é recomendado para substituir completamente o tampão presente no canal e evitar a diluição da amostra.
- Após carregar a amostra, clique imediatamente no botão Gravar para iniciar a coleta de dados, adquirindo um vídeo de 100 s (Figura 2D).
- No final da coleta de dados, insira o nome do arquivo e clique em OK para salvar o arquivo de dados.
- Descarte as lamínulas e limpe o óleo da lente objetiva com cotonetes ópticos de algodão úmidos com isopropanol.
nota: O protocolo pode ser pausado aqui.
4. Analise os dados do MP
- Processe o arquivo de vídeo coletado usando o software de processamento de dados MP para identificar os eventos de pouso.
- Use a opção de menu Arquivo/Abrir para carregar o arquivo para a análise e clique em Analisar.
- Clique no botão Carregar para carregar a função de calibração e salvar os dados analisados usando a opção de menu Arquivo/Salvar resultados como.
- Ajustar a distribuição de massa molecular com funções gaussianas para obter concentrações relativas de cada espécie na amostra. Essa análise pode ser realizada usando um software gráfico científico comum (consulte Tabela de Materiais).
- Importe o arquivo "eventsFitted.csv" para o software e plote a distribuição de massa molecular (coluna M no arquivo .csv) usando a função Plot/Statistics/Histogram.
- Clique duas vezes no histograma para abrir a janela Propriedades da plotagem. Desative o compartimentalização automática e selecione um tamanho de compartimento de 2,5 kDa. Clique nos botões Aplicar e Ir para criar os dados de Centros de Caixas e Contagens.
- Selecione as colunas Centros de compartimento e Contagens e use a função de menu Análise/Picos e Linha de base/Ajuste de pico múltiplo para ajustar o histograma às funções gaussianas. Clique duas vezes para indicar as posições de pico aproximadas no gráfico de distribuição e, em seguida, clique no botão Abrir NLFit.
- Marque as caixas de seleção Fixo para os centros de pico "xc" e defina seus valores para as massas moleculares esperadas do anticorpo livre e dos complexos antígeno-anticorpo simples e duplo. Marque a opção Compartilhar para os parâmetros de largura. Clique no botão Ajustar. Os valores de altura dos picos ajustados dos componentes gaussianos representam a concentração relativa de cada espécie na amostra.
nota: O tamanho do compartimento pode ser ajustado para otimizar a resolução do gráfico de distribuição de massa. O limite de precisão do MP é de aproximadamente 1 kDa, e tamanhos menores de compartimento podem amplificar o ruído da distribuição, sem revelar nenhuma informação adicional. Tamanhos de compartimento muito grandes obscurecerão os detalhes das distribuições em massa.
- Calcular a fração de concentração de cada espécie utilizando a seguinte equação:
em que os valores de HI e FI representam as alturas dos picos e as frações de concentração do anticorpo livre e do anticorpo de ligação simples e dupla na amostra, respectivamente.
