1. Preparação da almofada de agarose (Figura 1)
- Coloque uma lâmina de vidro de microscópio em uma superfície horizontal plana. Disponha duas lâminas de vidro cobertas com duas camadas de fita adesiva em cada lado da lâmina inicial.
nota: Mantenha um espaço de 1-2 mm entre as três lâminas alinhadas para evitar que a agarose derretida eventualmente se espalhe nas lâminas com fita adesiva.
- Pipete e despeje uma gota de 70 μL de agarose derretida a 1% na lâmina de vidro. Adicione uma quarta lâmina na parte superior para achatar a gota de agarose e pressione suavemente. Aguarde cerca de um minuto.
- Retire a lâmina superior e solte com uma pipeta cerca de 3 μL de bactérias em 3 a 4 pontos em locais diferentes na almofada de agarose.
- Cubra com uma lamínula de vidro de microscopia (por exemplo, uma espessura de 22x22 mm #1,5).
nota: O nivelamento e a espessura das lamínulas são importantes para trabalhar com excitações de dois fótons. Lamínulas de precisão com planicidade uniforme controlada e baixa autofluorescência geralmente são uma boa escolha.
- Fixe a lamínula com parafina derretida para selar a lamínula na lâmina de vidro. Comece fixando os quatro cantos da lamínula.
2. Imagem com uma configuração de microscopia de dois fótons
NOTA: Estamos usando um microscópio invertido de excitação de dois fótons caseiro com uma objetiva de imersão em água de 60x 1.2NA operando no modo de coleta de fluorescência de-scan. O comprimento de onda de excitação de dois fótons é definido em 930 nm. É fornecido por um laser Ti:Sapphire (taxa de repetição de 80 MHz, ≈ largura de pulso de 70 fs) trabalhando a 10-20 mW. Os fótons de fluorescência foram coletados através de um filtro passa-curta de 680 nm e um filtro passa-banda de 525/50 nm antes de serem direcionados para um fotodiodo de avalanche acoplado a fibra conectado a um módulo de contagem de fótons únicos correlacionados ao tempo (TCSPC). O microscópio também é equipado com uma lâmpada de fluorescência de transmissão. Vários microscópios FLIM-FRET estão agora disponíveis comercialmente e muitas instalações de imagem estão equipadas com configurações capazes de realizar medições FLIM-FRET.
- Use a lâmpada de fluorescência para focar a objetiva na monocamada de bactérias na amostra e selecione as regiões de interesse.
- Verifique se o obturador do laser de excitação está fechado e se a luz infravermelha proveniente do laser está bloqueada e não entra no microscópio.
cuidado: Atenção cuidadosa e vigilância constante devem ser dadas ao trabalhar com lasers pulsados por infravermelho, pois a luz do laser não pode ser vista pelos olhos, mas qualquer exposição direta transitória ou reflexão do laser pode ser extremamente prejudicial e criar danos irreversíveis aos olhos. Consulte os procedimentos e treinamento locais de segurança a laser antes de usar configurações de microscopia.
- Coloque a lâmina de microscopia no palco com as lamínulas voltadas para a objetiva.
- Verifique se a lâmpada de fluorescência está LIGADA.
- Gire a torre do cubo do filtro para selecionar o cubo eGFP e abra a fluorescência lamp obturador.
- Envie a luz de fluorescência em direção à ocular do microscópio.
Cuidado: Certifique-se de que os filtros apropriados sejam descartados no caminho da luz para descartar a luz de excitação direta proveniente da lâmpada de fluorescência que pode danificar os olhos.
- Concentre a objetiva nas bactérias usando o botão do microscópio.
- Selecione uma região de interesse na amostra traduzindo-a usando o joystick que controla o estágio motorizado
nota: A focagem é mais fácil com amostras altamente fluorescentes, permitindo que a fluorescência seja vista diretamente com os olhos.
- Mude a excitação do laser 2PE para medições FLIM-FRET.
- Envie o caminho de emissão de fluorescência de volta para o detector.
- Gire a torre do cubo do filtro para selecionar o cubo dicróico para o laser de 930 nm.
- Defina a potência do laser para 20 mW.
- Defina o tamanho da região de interesse para 30 μm. Esta operação ajusta a tensão que opera os espelhos galvo e define a amplitude de seus movimentos (Figura 2).
- Ligue o detector e comece a escanear a amostra - os botões iniciar e parar que controlam a varredura também controlam a abertura e o fechamento do obturador do laser, tanto por razões de segurança quanto para limitar o fotobranqueamento da amostra (Figura 2).
- Se necessário, ajuste o foco movendo levemente o botão de foco fino do microscópio.
- Escolha o campo de visão para a imagem movendo finamente a platina da interface do computador. Isso pode ser feito na configuração movendo a cruz na imagem no software de controle do microscópio (Figura 2) que definirá o novo centro da imagem e pressionando "Move Stage". Um bom campo de visão para aquisição corresponde a uma imagem com 10-30 bactérias imóveis, todas focadas corretamente (todas as bactérias estão no mesmo plano). Se estiver interessado em extrair dados FLIM-FRET de células únicas, certifique-se de que as bactérias estejam bem individualizadas (a segmentação de imagens será muito mais fácil).
