Ensaio de agregação celular para detectar interações trans entre moléculas de adesão celular

Abstract

Fonte: Restrepo, S., et al., Medindo Interações Transcelulares por meio da Agregação de Proteínas em um Sistema Celular Heterólogo. J. Vis. Exp. (2020)

Neste vídeo, demonstramos a técnica para medir as interações transcelulares entre moléculas de adesão celular sináptica por meio do ensaio de agregação de células HEK. Neste ensaio, um número igual de células HEK expressando uma molécula de adesão celular pré-sináptica desejada e uma proteína fluorescente são misturadas com células HEK expressando uma molécula de adesão celular pós-sináptica e outra proteína fluorescente. A interação entre as moléculas de adesão celular força as células a se agregarem, o que pode ser medido por microscopia de fluorescência.

Protocol

1. Cultura celular e transfecção

1. Faça mídia celular HEK com DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) suplementado com 4,5 g/L de glicose, L-glutamina e piruvato de sódio, e 10% de FBS. Filtro estéril.
2. Predeterminar ligantes e receptores adequados para o ensaio de agregação.
   nota: Neurexin3α SS4+/- e um de seus ligantes conhecidos, LRRTM2, foram usados neste estudo. Ligantes e receptores de interesse foram expressos a partir de cDNAs em pcDNA3.1. Um conjunto Gibson foi usado para inserir Neurexin3α em pcDNA3.1. Neurexin3α F/R:
   TTTAAACTTAAGCTTGGTACCGAGCTCGGATCCGCCACCATGAGCTTTACCCTCCACTC/
   GAGCGGCCGCCACTGTGCTGGATATCTGCAGAATTCTTACACATAATACTCCTTGTCCTT.
3. Prepare HEK293T células.
   1. Cultive HEK293T células até a confluência em um frasco T-75.
   2. Uma vez confluente, use 2 mL de tripsina e coloque em uma incubadora a 37 ° C por 2 min. Adicione 6 mL de meio HEK ao frasco para ressuspender as células e transfira todos os 8 mL para um tubo cônico de 15 mL.
   3. Pellet a 500 x g por 5 min e ressuspender em meio de célula HEK por um total de 8 mL.
   4. Conte as células e adicione 735.000 células em cada poço de uma placa de 6 poços. Ajuste o volume final para 2 mL para cada poço usando mídia de célula HEK.
   5. Coloque em uma incubadora a 37 °C e deixe as células crescerem durante a noite ou até atingirem 50-60% de confluência.
4. Transfecto HEK293T células usando o método de fosfato de cálcio.
   1. Transfecto bem-1 com 3 μg da proteína de interesse e co-transfecto com 1 μg de proteína fluorescente (3 μg de pcDNA3.1-Neurexin3α^WT SS4- e 1 μg de mCherry).
   2. Transfecto poço-2 como na etapa 1.4.1., mas com a proteína mutada de interesse (pcDNA3.1-Neurexin3α^A687T SS4-).
   3. Transfecto bem-3 com 3 μg do ligante de interesse e co-transfecto com 1 μg de outra proteína fluorescente (3 μg de pcDNA3.1 LRRTM2 e 1 μg de GFP).
   4. Transfecto poço-4 e poço-5 para servir como controles negativos: poço-4 com 1 μg de GFP e poço-5 com 1 μg de mCherry.
   5. Prepare outra placa (como nas etapas 1.4.1-1.4.4) se precisar de condições ou controles adicionais (Neurexin3α^{WT / A687T} SS4 +).
      nota: A eficiência da transfecção é analisada 24 h após a transfecção em um microscópio de epifluorescência e quantificada como o número de células que expressam a proteína fluorescente com a qual foram transfectadas. Uma abordagem mais simplificada incluiria a transfecção de células HEK com um vetor bicistrônico que codifica uma proteína fluorescente e o ligante de interesse e é altamente recomendada acima da co-transfecção. No caso deste estudo, as alfa Neurexinas são ~ 4,3 kb e baixa intensidade de fluorescência foi observada usando um sistema bicistrônico que necessita de co-transfecção.
5. 48 horas após a transfecção, colher células para agregação.
   1. Lave cada poço duas vezes com PBS.
   2. Adicione 1 mL de EDTA 10 mM em PBS em cada poço para dissociar suavemente as interações célula a célula e incubar a placa a 37 ° C por 5 min.
      nota: A tripsina não é recomendada para a etapa 1.5.b devido à potencial clivagem proteolítica das moléculas de adesão no estudo. Além disso, após a adição de EDTA, o protocolo não pode ser interrompido até a conclusão, pois as células agora serão expostas às condições ambientais.
   3. Bata suavemente na placa para separar as células e colha cada poço em tubos cônicos separados de 15 mL.
   4. Centrifugue os tubos cônicos a 500 x g e temperatura ambiente por 5 min.
6. Enquanto as células estão peletizando, prepare 6 tubos de incubação rotulando a parte superior de cada tubo de microcentrífuga com cada condição.
   nota: Cada permutação das condições GFP e mCherry deve ser usada para abranger todas as condições experimentais e controles adequados. Por exemplo: 1. GFP/mCherry, 2. mCherry/LRRTM2-GFP 3. GFP / Neurexin3α^WT SS4 - mCherry, 4. GFP/Neurexina3α^A687T SS4- –mCherry, 5. Neurexina3α^WT SS4-—mCherry/LRRTM2—GFP, 6. Neurexina3α^A687T SS4- –mCherry/LRRTM2—GFP. Faça tubos adicionais para acomodar outras condições e controles.
7. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 500 μL de meio HEK com 10 mM de CaCl₂ e 10 mM de MgCl₂ aquecidos a 37 °C.
   nota: A adição de CaCl₂ e MgCl₂ permite que as moléculas de adesão restabeleçam a ligação e só é necessária se os parceiros de interação transcelular em questão exigirem cátions divalentes para adesão.
8. Conte as células em cada tubo cônico de 15 mL usando um hemocitômetro e alíquota de 200.000 células de cada condição em um tubo apropriado da etapa 1.6 para uma mistura de 1:1 em um volume total de 500 μL.
   nota: Deve levar apenas 5 minutos por condição para contar e alíquotas de quantidades.
9. Incube os tubos à temperatura ambiente em um rotador de tubo lento.

2. Aquisição de imagens

1. Otimize os parâmetros de aquisição do microscópio para amostras específicas. Neste exemplo, as imagens foram tiradas em um microscópio de campo amplo. Use uma objetiva aérea 5x (NA: 0,15; WD: 20000 μm) para obter um campo grande o suficiente para análise.
2. Avalie a agregação basal imediatamente após misturar as duas condições das células HEK na etapa 1.8. Estas são agora as imagens do 'tempo zero'.
   1. Pipete 40 μL de cada mistura de amostra em uma lâmina de microscópio carregada e imagem sob fluorescência nos canais 488 e 561.
   2. Adquira três campos de visão diferentes em um plano de foco por gota de amostra.
3. Adquira as imagens finais em 60 min como a imagem de 'tempo 60'.
   1. Para obter a imagem de 'tempo 60' da mistura após uma incubação de 60 minutos, pegue outra amostra de 40 μL de cada condição de tubos rotativos e pipete cada amostra em uma lâmina carregada. Imagem como na etapa 2.2.
      nota: A agregação celular deve ser verificada a cada 15 minutos até que ocorra a saturação. O tempo de agregação dependerá das proteínas que estão sendo testadas.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microtubos descartáveis de 5 mL com tampas de pressão	VWR	89000-028	Incubação de população mista de células HEK
Unidade de filtro de fluxo rápido de 1000 mL, membrana aPES de 0,2 um	Thermo Fisher	Rolamento 567-0020	Esterilização de meios HEK
Tubos de centrífuga SpectraTube de 15 mL	Ciência de Ward	Rolamento 470224-998	Colheita de células HEK
Placas de cultura de tecidos estéreis de 6 poços	VWR	Rolamento 100062-892	Cultura de células HEK
Cloreto de cálcio	sigma	223506-500G	Transfecção de fosfato de cálcio, ressuspensão de células HEK
Centrífuga - Sorvall Legend RT	Produtos de laboratório Kendro	75004377	Colheita de células HEK
Incubadora de células CO2	Thermo Científico	HERACELL 150i	Incubação de células HEK durante o crescimento
DMEM, 1x (Dulbecco's Modification of Eagle's Medium) com 4,5 g/L de glicose, L-glutamina e piruvato de sódio	Corning	10-013-CV	Manutenção de células HEK
Dulbecco's Fosfato-Bufferizado Solução Salina PBS (1X)	Gibco	14190-144	Passagem/coleta de célula HEK
Ácido etilenodiaminotetracético	sigma	ED-500G	Colheita de células HEK
Frascos de cultura ventilados Falcon, área de crescimento de 75cm2	Corning	Rolamento 9381M26	Cultura de células HEK
Soro fetal bovino	sigma	17L184	Manutenção de células HEK
HEK293T células	ATCC		Sistema de modelo
ImagemJ	Nih	V: 2.0.0-rc-69/1.52p	Análise de imagem
Cloreto de magnésio hexahidratado	sigma	M9272-500G	Ressuspensão de células HEK
Fosfato de sódio dibásico anidro	BioReagentes Fisher	BP332-500	Transfecção de fosfato de cálcio
Solução de tripsina 0,25% (1X)	Ciências da Vida da GE Healthcare	SH30042.01	Células HEK de passagem
Rotador de tubo			Incubação de população mista de células HEK
Lâminas de microscópio UltraClear. Branco fosco, carregado positivamente	Denville Scientific Inc.	M1021	Aquisição de imagem
Microscópio de campo amplo	Zeiss	Axio Vert 200M	Aquisição de imagem