NOTA: Este protocolo usa cepas de C. elegans nas quais os parceiros potenciais de interação são marcados. É altamente recomendável que uma cepa de controle negativo seja usada, na qual não se espera que uma proteína marcada interaja com outro parceiro de interação candidato marcado. Aqui, a GFP sozinha foi usada como um controle negativo para avaliar o histórico, já que não se espera que o DLC-1 interaja com a GFP no worm. OMA-1 marcado com GFP foi usado como cepa experimental, pois dados preliminares sugerem uma interação com DLC-1. As cepas de nematóides que co-expressam proteínas de controle e teste com DLC-1 marcado com 3xFLAG são referidas neste texto como 3xFLAG::D LC-1; GFP e 3xFLAG: :D LC-1; OMA-1::GFP (cepas disponíveis mediante solicitação; mais informações na Tabela de Materiais), respectivamente. Aqui, as tags 3xFLAG e GFP são usadas; no entanto, outras etiquetas podem ser substituídas, desde que seus anticorpos sejam compatíveis com os reagentes do kit PLA.
1. Cuidados com os animais
- Mantenha os vermes em placas de meio de crescimento de nematóides (NGM) semeadas com a cepa OP50 de E. coli e mantenha a 24 ° C para expressão ideal de GFP.
- Passe vermes adultos a cada 2-3 dias para propagar vermes e mantê-los bem alimentados.
2. Preparação da cultura síncrona
- Sincronize vermes branqueando um prato de hermafroditas bem alimentados e grávidas. Um protocolo de clareamento é descrito em Porta-de-la-Riva et al. Deixe os embriões eclodirem durante a noite em um tubo de centrífuga a 24 ° C enquanto gira de ponta a ponta em 10 mL de tampão de meio mínimo M9 (M9). Isso produzirá uma cultura de larvas L1 presas.
- Incube o tubo de larvas de estágio L1 presas no gelo por 10 min e, em seguida, complete o tubo com 1x M9 gelado.
- Use uma centrífuga para peletar as larvas a 600 x g por 5 min a 4 ° C. Aspire cuidadosamente o sobrenadante para que apenas 1-2 mL de sobrenadante permaneçam.
- Ressuspenda o pellet de larvas e use uma micropipeta para transferir 2 μL de cultura de larvas suspensas para uma lâmina de vidro. Conte quantas larvas estão presentes para determinar a densidade da cultura de larvas, o que ajudará a orientar a semeadura dos vermes na etapa 2.5.
nota: Uma densidade de 10-15 larvas L1 / 1 μL funciona bem para a semeadura.
- Use uma micropipeta para transferir o volume de cultura de larvas necessário para semear aproximadamente 100-120 larvas do estágio L1 em uma placa OP50 de 60 mm. Por exemplo, semear 10 μL de uma cultura de larvas que tem uma densidade de 10 larvas L1/1 μL de cultura.
nota: Não exceda um volume de 40 μL para semear as larvas, ou o excesso de líquido interromperá o gramado OP50. Se o volume da cultura exceder 40 μL, repita as etapas 2.3-2.4 para reduzir ainda mais o volume e aumentar a densidade da cultura de larvas.
- Cultive minhocas a 24 °C. Registre o momento em que as L1s são semeadas na placa e verifique periodicamente o estágio de desenvolvimento para identificar o momento ideal para a dissecação.
nota: Às 52 h após a semeadura de L1s, os vermes cultivados a 24 ° C estão tipicamente no estágio de adulto jovem, que é o estágio ideal para a dissecção de PLA direcionado às gônadas. No entanto, o tempo real em que os vermes sincronizados atingem o estágio adulto jovem pode variar entre as cepas e a temperatura de incubação.
3. Dissecção/extrusão de gônadas
NOTA: A dissecção para extrudar a gônada é necessária para que o PLA direcionado às gônadas funcione com sucesso. Essa abordagem também pode liberar embriões, que também funcionam usando esse protocolo para PLA (consulte Discussão para obter mais informações). Após a dissecção, as amostras de controle negativo e experimentais são fixadas e tratadas para PLA juntas em paralelo. Sugere-se também que um conjunto adicional de amostras seja preparado para fins de co-imunocoloração fluorescente para demonstrar os padrões de expressão dos parceiros proteicos de interesse.
- Escolha 30-40 vermes adultos jovens em um prato de vidro de relógio contendo 500 μL de 1x M9 + levamisol (concentração final de 2,5 mM). Depois de coletar os vermes, remova e descarte cuidadosamente a maior parte da mídia para remover as bactérias que são transferidas junto com os vermes.
- Adicione 500 μL frescos de 1x M9 + levamisol e use a pipeta para aspirar e dispensar suavemente o meio para enxaguar os vermes. Remova e descarte cuidadosamente a maior parte da mídia para eliminar as bactérias que são transferidas junto com os vermes.
- Repita esta etapa 2x-3x até que todas as bactérias sejam removidas. Após a conclusão das lavagens, deixe as minhocas em cerca de 100 μL de meio para se manter hidratado.
nota: Não deixe os vermes ficarem no meio por mais de 7 min, pois isso prejudicará a extrusão das gônadas durante a dissecção. Realize lavagens com auxílio de microscópio de dissecação para monitorar a remoção do meio para que os vermes não sejam perdidos.
- Usando uma pipeta de vidro ou polietileno, transfira os sem-fins para uma lâmina de microscópio de 25 mm x 75 mm revestida com 0,001% de poli-L-lisina (as lâminas usadas neste procedimento têm um perímetro revestido com epóxi, deixando três espaços de trabalho, 14 mm x 14 mm cada). Remova o excesso de mídia para que restem aproximadamente 10-15 μL de mídia.
- Com o auxílio de um microscópio de dissecação e usando duas agulhas de calibre 261/2, coloque uma agulha sobre a outra de modo que as pontas formem uma tesoura. Usando agulhas orientadas dessa maneira, corte os vermes atrás da faringe para liberar as linhas germinativas. Disseque todos os vermes em 5 minutos.
nota: Mais detalhes sobre como realizar dissecções podem ser encontrados em uma publicação anterior de Gervaise e Arur.
- Depois que todos os vermes forem dissecados, coloque suavemente uma lamínula de 22 mm x 40 mm sobre a lâmina para que fique perpendicular à lâmina. As extremidades da lamínula devem ficar penduradas no slide.
- Congele as lâminas em um bloco de alumínio pré-resfriado mantido em gelo seco por pelo menos 20 min. Coloque delicadamente um lápis resfriado em cima da lamínula para evitar que a lamínula se solte devido à expansão do gelo.
4. Fixação/bloqueio
- Quando estiver pronto para fixação, retire as lamínulas com um lápis ou outra ferramenta de ponta cega e mergulhe imediatamente a lâmina em uma jarra contendo metanol fresco e gelado (resfriado a -20 ° C) por 1 min.
- Limpe suavemente as bordas da lâmina que circundam a amostra para que o próximo reagente seja retido pela tensão superficial ao redor da amostra. Aplicar 150 μL de fixador (formaldeído a 2% em KH100mM 2 PO4, pH = 7,2) por 5 min em RT.
nota: Também testamos um procedimento de fixação de metanol/acetona e descobrimos que ele é compatível com a reação de PLA.
- Toque a lâmina em uma toalha de papel em um ângulo perpendicular de 90° para deixar o fixador escorrer da lâmina e absorver pela toalha de papel. Bloquear lâminas 2x por 15 min em RT em frasco de Coplin com 50 mL de 1x PBS/1% Triton X-100/1% de albumina de soro bovino (PBT/BSA).
nota: Frascos de Coplin ou outros tipos de frascos de coloração são recomendados para esta etapa de bloqueio e as etapas de lavagem abaixo nas seções 6-9. Estes fornecem volumes suficientes para uma troca eficiente de tampão de bloqueio ou lavagem com a amostra.
- Bloqueie as lâminas com uma solução PBT/BSA contendo 10% de soro de cabra normal. Limpe suavemente as bordas que circundam a lâmina e aplique 100 μL da solução na lâmina. Incubar por 1 h em RT em câmara úmida.
nota: Esta etapa é altamente recomendada para coloração com o anticorpo primário αFLAG. A câmara úmida é construída prendendo pipetas de vidro com fita adesiva na bandeja para que as lâminas sejam colocadas enquanto incubam. Toalhetes de tarefas umedecidos (Tabela de Materiais) são colocados na bandeja para aumentar a umidade interna da bandeja para evitar a evaporação. A tampa e a bandeja são cobertas com papel alumínio para proteger as amostras da luz durante as etapas sensíveis à luz.
- Coloque a lâmina em uma toalha de papel para deixar a solução PBT/BSA/10% NGS escorrer da lâmina e limpe suavemente as bordas da lâmina. Use o reagente de bloqueio (Tabela de Materiais) para bloquear slides. Aplique uma gota no espaço de 14 mm x 14 mm. Incubar as lâminas durante 1 h a 37 °C numa câmara húmida.
5. Incubação primária de anticorpos
NOTA: Para obter os melhores resultados de PLA e fundo mínimo, o fator de diluição dos anticorpos primários pode exigir otimização (consulte Discussão para obter mais detalhes). Além disso, os anticorpos primários devem ser criados em diferentes hospedeiros que correspondam à especificidade dos anticorpos secundários usados para PLA.
- Coloque a lâmina em uma toalha de papel para deixar o reagente bloqueador escorrer da lâmina e limpe suavemente as bordas. Use o diluente de anticorpos (Tabela de Materiais) para diluir os anticorpos primários. Aplique 40 μL de solução de anticorpo primário por espaço de 14 mm x 14 mm.
- Incubar as lâminas numa câmara húmida durante a noite a 4 °C.
6. Incubação da sonda PLA (anticorpo secundário)
NOTA: Para as etapas 6 a 9, use os buffers de lavagem A e B em RT. Se os tampões forem armazenados a 4 °C, deixe-os aquecer até a temperatura de recarga antes de usar.
- Lave as lâminas 2x por 5 min com 50 mL de 1x tampão de lavagem A (Tabela de Materiais) em RT em um frasco Coplin. Coloque o frasco Coplin em um agitador orbital ajustado para 60 rpm.
- Coloque a lâmina em uma toalha de papel para deixar o amortecedor de lavagem escorrer da lâmina e limpe suavemente as bordas. Preparar uma solução de 40 μL contendo as sondas PLUS e MINUS (diluída a 1:5 com diluente de anticorpos). Aplicar a solução em cada espaço de 14 mm x 14 mm.
- Incubar as lâminas numa câmara húmida durante 1 h a 37 °C.
7. Ligadura
- Lave as lâminas 2x por 5 min com 50 mL de 1x tampão de lavagem A em RT em um frasco Coplin. Coloque o frasco Coplin em um agitador orbital ajustado para 60 rpm.
- Diluir o tampão de ligação (Tabela de Materiais) 1:5 com água ultrapura. Use este tampão para diluir a ligase (Tabela de Materiais) 1:40 para preparar um estoque de trabalho de solução de ligação.
- Coloque a lâmina em uma toalha de papel para deixar o tampão de lavagem escorrer da lâmina e limpe suavemente as bordas. Aplicar 40 μL da solução de ligação em cada espaço de 14 mm x 14 mm.
- Incubar as lâminas em uma câmara úmida por 30 min a 37 °C.
8. Amplificação
NOTA: O uso de reagentes de detecção com fluoróforos vermelhos (Tabela de Materiais) resulta na menor quantidade de fundo no tecido de C. elegans.
- Lave as lâminas 2x por 5 min com 50 mL de 1x tampão de lavagem A em RT em um frasco Coplin. Coloque o frasco Coplin em um agitador orbital ajustado para 60 rpm.
- Dilua o tampão vermelho de amplificação (Tabela de Materiais) 1:5 com água ultrapura. Use este tampão para diluir a polimerase (Tabela de Materiais) 1:80 para preparar um estoque de trabalho de solução de amplificação e proteger da luz.
- Coloque a lâmina em uma toalha de papel para deixar o tampão de lavagem escorrer da lâmina e limpe suavemente as bordas. Aplique 40 μL da solução de amplificação em cada espaço de 14 mm x 14 mm.
- Incube as lâminas em uma câmara úmida por 1 h e 40 min a 37 °C. Certifique-se de que a câmara úmida esteja coberta com papel alumínio para proteger as amostras da luz.
9. Lavagens finais
- Lave as lâminas 2x por 10 min com 50 mL de 1x tampão de lavagem B (Tabela de Materiais) em RT em um frasco Coplin. Coloque o frasco Coplin em um agitador orbital ajustado para 60 rpm.
- Lave as lâminas 1x por 1 min com 50 mL de 0,01x tampão de lavagem B em RT em um frasco Coplin. Coloque o frasco Coplin em um agitador orbital ajustado para 60 rpm. Este tampão é preparado diluindo o tampão de lavagem B com água ultrapura.
10. Montagem da lamínula
- Deixe o excesso de tampão de lavagem escorrer da lâmina para uma toalha de papel e limpe qualquer tampão residual restante no perímetro revestido de epóxi da lâmina.
- Adicione 10 μL de meio de montagem (Tabela de Materiais) à amostra e coloque suavemente uma lamínula por cima, permitindo que o meio de montagem se espalhe.
- Pinte ao redor da borda da lamínula com esmalte para selar a lamínula e deslizar. Seja gentil com a aplicação de esmalte para evitar mover a lamínula, o que danificará as linhas germinativas. Deixe o esmalte endurecer por pelo menos 20 min em RT, enquanto as lâminas são protegidas da luz, antes de visualizá-lo ao microscópio.
