1. Imunoprecipitação
NOTA: Usamos tampão de lise de dodecil sulfato de sódio (SDS) não sódico e eluição de citrato, conforme descrito nas seções a seguir. No entanto, o uso de uma técnica alternativa de imunoprecipitação interna também pode ser aplicável para a preparação de amostras de LC-MS/MS.
- Células cultivadas transfectas com vetores que codificam apenas uma etiqueta de epítopo ou uma proteína de fusão. Para adquirir dados representativos, transfira células J774 (1 x 106) com vetores que codificam uma proteína fluorescente verde (GFP) sozinha ou Capn6 fundido com GFP (gene calpaína-6) usando lipossomas catiônicos.
- Conjugar o anticorpo com as esferas magnéticas.
- Para este fim, misture o anticorpo anti-GFP (2 μL / reação) com esferas magnéticas (25 μL / reação) em 500 μL de tampão fosfato de citrato (24,5 mM de ácido cítrico, 51,7 mM de fosfato de sódio dibásico; pH 5,0) em um tubo de ensaio de 1,5 mL.
- Gire a mistura a 50 rpm por 1 h em temperatura ambiente. Em seguida, lave as esferas conjugadas com IgG três vezes com tampão fosfato de citrato contendo 0,1% de monolaurato de polioxietileno (20) sorbitano.
- Lise as células transfectadas usando um tampão de lise apropriado. Para a aquisição de dados representativos, lisar as células transfectadas durante 30 min em gelo em 400 μL de tampão lise (50 mM de Tris-HCl; pH 7,5, 120 mM de NaCl, 0,5% de éter poli(oxietileno) octilfenílico) contendo 40 μmol/L de fluoreto de fenilmetilsulfonil, 50 μg/ml de leupeptina, 50 μg/ml de aprotinina, 200 μmol/L de ortovanadato de sódio, e 1 mM de ácido etilenoglicol tetracético (EGTA) em tubos de ensaio de 1,5 mL 24 h após a transfecção.
- Limpar o lisado centrifugando a 15.000 x g durante 5 min e recolher o sobrenadante.
- Pré-limpe o lisado. Adicione esferas magnéticas não marcadas (25 μL / reação) em um tubo de ensaio de 1,5 mL. Lave as esferas três vezes com 500 μL de tampão citrato fosfato. Após a remoção do tampão fosfato de citrato na lavagem final, adicione o lisado celular sobre os grânulos magnéticos. Gire a mistura usando um rotador a 50 rpm por 30 min em temperatura ambiente.
- Coloque o tubo de ensaio em um suporte magnético por 5 min para separação magnética e colete o lisado celular. Recomenda-se o uso do suporte magnético designado pelo fabricante.
- Ligue as proteínas-alvo às esferas conjugadas. Coloque as esferas conjugadas com imunoglobulina (Ig)G em um suporte magnético por 5 min para separação magnética, descarte o tampão citrato e, em seguida, adicione o lisado celular às esferas separadas.
- Gire a mistura a 50 rpm por 1 h em temperatura ambiente.
- Separe as proteínas-alvo das proteínas não-alvo livres. Lave as esferas três vezes usando 500 μL de tampão fosfato de citrato contendo 0,1% de monolaurato de polioxietileno (20) sorbitano. Após a lavagem final, adicione 30 μL de tampão citrato (pH 2–3) e incube por 5 min em temperatura ambiente para eluir as proteínas-alvo.
nota: Se a recuperação da imunoprecipitação for insuficiente, o uso de marcadores de epítopos alternativos, como FLAG ou HIS, pode melhorar a eficiência. Se a eficiência da eluição for insuficiente, o uso de outros eluentes, como uma solução baseada em SDS, pode melhorar a eficiência.
2. Digestão de proteínas na membrana
NOTA: O uso de materiais e equipamentos livres de proteínas é necessário para evitar a contaminação com proteínas exógenas. Além disso, recomenda-se que o operador use máscara cirúrgica e luvas para evitar a contaminação por proteínas humanas.
- Corte as membranas de PVDF em pedaços de 3 mm x 3 mm usando uma tesoura cirúrgica que foi limpa com metanol e seca imediatamente antes do uso.
- Adicione 2–5 μL de etanol aos pedaços de membrana de PVDF em papel alumínio limpo.
- Antes de secarem completamente, adicione o eluente (2 a 5 μL cada, 4 a 6 peças por amostra) nas membranas hidrofílicas de PVDF e, em seguida, seque as membranas ao ar até que a superfície da membrana fique fosca. As membranas secas podem ser armazenadas a 4 °C.
- Transfira todas as membranas para tubos plásticos de 1,5 mL, adicione 20–30 μL de etanol para tornar as membranas hidrofílicas e, em seguida, remova o etanol usando uma pipeta.
- Antes que a membrana seque completamente, adicione 200 μL de solução de reação à base de ditiotreitol (DTT) (80 mM NH4HCO3, 10 mM DTT e 20% de acetonitrila) e incube-a a 56 ° C por 1 h.
- Substitua a solução de reação por 300 μL de solução de iodoacetamida (80 mM NH4HCO3, 55 mM de iodoacetamida e 20% de acetonitrila) e incube por 45 min em temperatura ambiente no escuro.
- Lave as membranas duas vezes com 1 mL de água destilada e uma vez com 1 mL de acetonitrila a 2% por mistura de vórtice por >10 s.
- Dissolva a tripsina liofilizada de grau MS (Tabela de Materiais) diretamente na solução de reação (30 mM NH4HCO3 contendo 70% de acetonitrila). Adicionar 100 μL da solução de reação contendo 1 μg de tripsina (Tabela de Materiais) (30 mM NH4HCO3 contendo 70% de acetonitrila) e incubar a 37 ° C durante a noite.
- Transfira a solução de reação contendo os digeridos trípticos para um tubo de ensaio limpo de 1,5 mL usando uma pipeta.
- Adicionar 100 μL de solução de lavagem (acetonitrila a 70%) / ácido trifluoroacético a 1%) à membrana e incubá-la a 60 °C por 2 h. Recolher a solução de lavagem e misturá-la com a solução de reação. Adicione mais 100 μL de solução de lavagem à membrana e sonice por 10 min. Em seguida, recolha a solução de lavagem e misture-a com a solução de reação.
- Cubra o tubo de ensaio com um pedaço de filme de laboratório e faça alguns pequenos orifícios com uma agulha. Seque a solução usando um concentrador de vácuo.
- Dissolva o resíduo em 10 μL de ácido fórmico a 0,2%. Após centrifugação (12.000 × g, 3 min à temperatura ambiente), transferir o sobrenadante para um tubo de amostra.
nota: As lavagens são as etapas críticas desta seção. Durante a digestão de proteínas na membrana, a lavagem das membranas contendo as proteínas imobilizadas após redução e alquilação com água destilada, seguida de acetonitrila a 2%, por mais de 10 segundos cada, é fundamental para a remoção dos reagentes.
