Tecnologia de interferometria de biocamada para detectar interações entre ligante e analito

Resumo

Fonte: Desai, M., et al. Aplicação de interferometria de biocamada (BLI) para estudar interações proteína-proteína na transcrição. J. Vis. Exp. (2019)

Neste vídeo, demonstramos a tecnologia de interferometria de biocamada (BLI) para detectar as interações intermoleculares entre ligantes e analitos alvo em tempo real. O BLI mede as mudanças no padrão de interferência da luz branca refletida por uma camada de ligantes imobilizados na superfície de um biossensor à medida que interagem com os analitos em solução.

Protocolo

1. Hidratação do biossensor e configuração do ensaio

1. Ligue a máquina BLItz.
2. Certifique-se de que a máquina esteja conectada ao computador por meio de uma porta de saída de dados USB na parte traseira da máquina.
3. No computador, abra o software associado (por exemplo, BLItz Pro) e clique em Cinética Avançada no lado esquerdo da tela.
4. No software, digite todas as informações apropriadas sobre o experimento (incluindo o Nome do Experimento, Descrição, ID da Amostra e Concentração de Proteína) em cada título respectivo.
5. Clique em Tipo de biossensor e escolha Ni-NTA no menu suspenso.
   1. No cabeçalho Configurações de execução, verifique se o Shaker está definido como Habilitar.
   2. No cabeçalho Lista de tipos de etapas, verifique se há 5 itens listados: Linha de base inicial, Carregamento, Linha de base, Associação e Dissociação.
      nota: A duração de cada etapa pode ser alterada do padrão, conforme necessário. Para obter os melhores resultados, use um mínimo de 30 s para a linha de base inicial e a linha de base; e 120 s para Associação e Dissociação. A duração da etapa de carregamento (variando de 120 a 240 s) dependerá da concentração do ligante e da afinidade da etiqueta do epítopo His no ligante com o biossensor Ni-NTA.
6. Remova o biossensor Ni-NTA hidratado do tubo de PCR e fixe-o no suporte do biossensor na máquina deslizando a parte larga do biossensor no suporte.
   nota: Não deixe o biossensor secar durante o experimento.
7. Coloque um tubo de microcentrífuga preto de 0,5 mL no suporte do tubo da máquina e pipete 400 μL do tampão BLI nele.
8. Verifique se o controle deslizante da máquina está posicionado de forma que o suporte do tubo fique na frente da seta preta na máquina.
9. Feche a tampa da máquina de forma que a ponta do biossensor fique submersa no tampão do tubo da microcentrífuga.
10. Clique em Avançar no software para começar a gravar a linha de base inicial.

2. Carregamento de ligante no biossensor

1. Depois que a etapa da linha de base inicial terminar de gravar, abra a tampa da máquina.
2. Mova o controle deslizante para a direita de modo que o suporte de queda (em vez do suporte do tubo) fique situado na frente da seta preta.
3. Pipete 4 μL de um ligante dialisado marcado com His no suporte de gota e feche a tampa da máquina.
   NOTA: A concentração ideal do ligante a ser usado pode variar para cada proteína. Uma concentração entre 1,0 a 2,0 mg/mL é geralmente adequada para saturar o NTA na ponta do biossensor em 240 s.
4. No software, clique em Avançar para começar a carregar.

3. Lavando o ligante adicional

1. Depois que a etapa de carregamento terminar de gravar, abra a tampa da máquina.
2. Mova o controle deslizante para a esquerda de modo que o suporte do tubo fique novamente situado na frente da seta preta.
3. Feche a tampa da máquina e certifique-se de que a ponta do biossensor esteja submersa no tampão BLI do tubo no suporte do tubo.
4. Clique em Avançar mais uma vez no software para começar a gravar a linha de base.

4. Associação da substância a analisar com o ligante

1. Depois que a etapa Linha de base terminar de gravar, abra a tampa da máquina.
2. Remova o porta-gotas e limpe-o pipetando qualquer proteína e enxaguando-o com água duplamente deionizada (ddH₂O) por um total de 5 vezes.
   1. Use um lenço de papel para limpar a superfície do porta-gotas após a lavagem.
3. Recoloque o suporte de queda de volta na máquina.
4. Mova o controle deslizante na máquina para a direita, de modo que o suporte de queda fique novamente situado na frente da seta preta.
5. Pipetar 4 μL de um analito dialisado no suporte de gotas e fechar a tampa da máquina.
6. No software, clique em Avançar para iniciar a Associação.

5. Dissociação da substância a analisar do ligante

1. Depois que a etapa Associação terminar de gravar, abra a tampa da máquina.
2. Mova o controle deslizante na máquina para a direita, de modo que o suporte do tubo fique novamente situado na frente da seta preta.
3. No software, clique em Avançar para iniciar a Dissociação.
4. Depois que a etapa de Dissociação terminar de gravar, abra a tampa da máquina.
5. Remova o suporte de queda e o suporte do tubo.
6. Enxágue bem ambos com ddH₂O para remover qualquer proteína.
7. Remova o biossensor e descarte-o com segurança.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Máquina BLItz	ForteBio	45-5000	dispositivo
Bandeja de biossensor Ni-NTA Dip and Read	ForteBio	18-5101	Biossensores Ni-NTA prontos para uso para proteínas marcadas com poli-His
Suporte de queda	ForteBio	Telefone: 45-5004	dispositivo
Tubos de PCR (0,2 mL)	Thomas Científico	CLS6571	Artigos de plástico
Tubos de microcentrífuga (pretos)	Thermo Fisher Científico	03-391-166	Artigos de plástico
Kimwipes	Thermo Fisher Científico	06-666A	Artigos de plástico
TDT	Thermo Fisher Científico	R0861	químico
Edta	MilliporeSigma	E6758	químico
MgCl2	MilliporeSigma	M8266	químico
NaCl	MilliporeSigma	S9888	químico
Tris-HCl	Ouro Bio	T095100	buffer