$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Preparação da amostra: ensaio de mistura célula-célula
NOTA: O protocolo a seguir descreve o procedimento de mistura para células aderentes. Pode ser modificado para células cultivadas em suspensão.
- Semeie um número apropriado de células em uma placa de 6 poços, por exemplo, 800.000 células HEK 293T (contadas com uma câmara de contagem de Neubauer), um dia antes da transfecção. O número pode ser modificado dependendo do tempo entre a semeadura e a transfecção e ajustado para outros tipos de células. Para realizar um experimento básico (ou seja, proteínas de interesse e controle negativo), prepare pelo menos 4 poços. Células de cultura a 37 °C, 5% de CO2 em meio Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM), suplementado com soro fetal bovino (10%) e L-glutamina (1%).
- Células transfectuadas de acordo com as instruções do fabricante (ver Tabela de Materiais).
- Para realizar um experimento básico, transfecte, em poços separados, plasmídeos para a proteína de interesse fundidos a uma proteína fluorescente verde 'verde' (por exemplo, proteína fluorescente verde aprimorada monomérica (mEGFP) ou proteína fluorescente amarela (mEYFP)) ou 'vermelha' (por exemplo, mCherry ou mCardinal).
nota: Neste protocolo, nos concentramos em APLP1-mEYFP e APLP1-mCardinal, e o controle negativo correspondente, por exemplo, miristotilado-palmitoilado-mEYFP (myr-palm-mEYFP) e -mCardinal (myr-palm-mCardinal). Geralmente, 200 ng - 1 μg de DNA de plasmídeo são suficientes. A alta eficiência de transfecção aumenta a chance de encontrar células "vermelhas" e "verdes" em contato. Modifique a quantidade de plasmídeo e reagente de transfecção para otimizar a eficiência da transfecção. crítico: A confluência celular deve estar em torno de 70% ao transfectar as células. Se as células forem excessivamente confluentes, a eficiência da transfecção diminuirá. Se as células não forem confluentes o suficiente, a transfecção e a mistura podem induzir estresse e impedir que muitas células se fixem adequadamente após a mistura.
- Realize a mistura de células ~ 4 ± 2 h após a transfecção.
- Remova o meio de crescimento e lave cada bem suavemente com 1 mL de PBS suplementado com Mg2+ e Ca2+. Em seguida, remova o PBS. (Crítico) Solte o PBS na borda do poço para evitar o desprendimento das células durante a lavagem.
- Adicione ~ 50 μL de solução de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) de tripsina gota a gota a cada poço para facilitar o desprendimento das células. Incubar a 37 °C durante 2 min. Em seguida, agite lentamente a placa de 6 poços lateralmente para separar as células.
nota: Tempos de incubação prolongados podem ser necessários para alguns tipos de células.
- Adicione 950 μL de meio de crescimento a cada poço e ressuspenda as células pipetando algumas vezes para cima e para baixo, destacando assim todas as células do fundo do poço. (Crítico) Certifique-se de que as células sejam ressuspensas adequadamente e separadas umas das outras, verificando visualmente a ausência de grandes agregados de células após a ressuspensão. Caso contrário, muitos contatos 'vermelhos'-'vermelhos' ou 'verdes'-'verdes' serão obtidos após a mistura.
- Transfira a solução celular de um poço (proteína de interesse ou controle negativo) para o poço correspondente, ou seja, células 'vermelhas' (por exemplo, APLP1-mCardinal transfectadas) para 'verdes' (por exemplo, APLP1-mEYFP transfectadas). Misture pipetando suavemente algumas vezes para cima e para baixo. Em seguida, semeie as células misturadas em placas com fundo de vidro de 35 mm (1 mL de solução de células mistas por placa, mais 1 mL de meio de crescimento) e cultive as células semeadas por mais um dia a 37 ° C, 5% CO2.
2. Preparação da amostra: controle positivo para experimentos de correlação cruzada e construto homodímero para análise de brilho
- Semear 600.000 células HEK 293T, contadas com uma câmara de contagem de células, em placas de fundo de vidro de 35 mm um dia antes da transfecção. Cultivar as células a 37 °C, 5% de CO2 num meio DMEM completo (ver passo 1.1) durante outro dia.
- Células transfectadas com ~ 250 ng de DNA de plasmídeo de acordo com as instruções do fabricante. Para o controle de correlação cruzada positiva, use um plasmídeo que codifica um heterodímero de proteína fluorescente ancorado na membrana, por exemplo, myr-palm-mCherry-mEGFP ou myr-palm-mCardinal-mEYFP correspondente aos FPs da proteína de interesse. Para calibração de brilho, use plasmídeos que codificam um monômero FP ancorado na membrana e um homodímero correspondente aos FPs fundidos à proteína de interesse, por exemplo, myr-palm-mEYFP e myr-palm-mEYFP-mEYFP para calibrar a análise de brilho de APLP1-mEYFP.
- Cultivar células a 37 °C, 5% de CO2 em meio DMEM completo (ver passo 1.1) por mais um dia.
3. Microscopia Confocal de Varredura a Laser: Configuração e Calibração de Volume Focal
NOTA: O protocolo a seguir foi escrito para experimentos realizados com mEGFP/mEYFP e mCherry/mCardinal no microscópio confocal de varredura a laser usado neste estudo. A configuração óptica, as configurações do software (linhas de laser, espelhos dicróicos, filtros) e a escolha dos corantes de calibração podem ser modificadas para outros FPs e configurações de microscópio.
- Ligue o microscópio e os lasers pelo menos uma hora antes do experimento para garantir a estabilidade do laser e o equilíbrio da temperatura.
- Prepare 100-200 μL de soluções de corante fluorescente solúveis em água apropriadas (consulte a Tabela de Materiais para exemplos) em água ou PBS para calibrar o volume focal, com concentrações na faixa de 10-50 nM.
- Coloque as soluções de corante em um prato limpo de fundo de vidro de 35 mm #1,5, ou seja, com espessura de 0,16-0,19 mm.
nota: Idealmente, use pratos com vidro de cobertura de alto desempenho com uma tolerância de baixa espessura, por exemplo, 0,170 ± 0,005 mm, permitindo uma correção ideal do anel do colar (passo 3.6). É importante usar o mesmo tipo de prato usado posteriormente para os experimentos a seguir.
- Coloque o prato contendo a solução de corante diretamente sobre a objetiva (de preferência, imersão em água, com NA 1.2) para garantir o foco na solução. Alternativamente, coloque o prato no porta-amostras e concentre-se na amostra (por exemplo, 10-20 μm acima do fundo do prato).
NOTA: Não recomendamos o uso de objetivas de óleo devido ao sinal fraco obtido ao focar profundamente em amostras aquosas.
- Configure o caminho de excitação e emissão, por exemplo, escolha o laser de 488 nm, um espelho dicróico de 488/561 nm, janela de detecção de 499-552 nm e um tamanho de orifício de 1 unidade Airy (AU). Certifique-se de que o tamanho do orifício seja o mesmo que será usado nas medições de correlação cruzada.
- Ajuste a posição do orifício (ajuste do orifício) e o anel do colar da objetiva para maximizar a taxa de contagem. Para isso, gire o anel do colar até que a taxa máxima de contagem seja detectada.
nota: A correção do anel do colar leva em conta a espessura específica da lamínula usada. Maximizar a taxa de contagem, ou seja, coletar o maior número possível de fótons por molécula, é crucial para maximizar a relação sinal-ruído (SNR) das medições.
- Realize uma série de medições pontuais de FCS (por exemplo, 6 medições em locais diferentes, cada uma consistindo em 15 repetições de 10 s, ou seja, 2,5 min de tempo total, amostradas com 1 μs de tempo de permanência ou menos) com a mesma potência do laser usada em medições de correlação cruzada (normalmente ~ 1%, ou seja, ~ 1-2 μW).
- Ajuste um modelo de difusão tridimensional incluindo uma contribuição tripla (Equação 1) aos dados.
nota: Normalmente, os tempos de difusão obtidos são em torno de 30 μs e o fator de estrutura é em torno de 4-8.
- Calcular a cintura w0 a partir do tempo médio de difusão medido e dos valores publicados para o coeficiente de difusão do corante utilizado à temperatura ambiente de acordo com a Equação 2.
Os valores típicos são 200-250 nm.
- Repita a rotina de calibração (etapas 3.4-3.9) com um corante fluorescente diferente para um segundo canal de detecção, se necessário (por exemplo, excitação de 561 nm e detecção entre 570 nm e 695 nm). Mantenha a posição e o tamanho do orifício como foram definidos para o primeiro canal de detecção.
- Calcule o brilho molecular (Equação 3) a partir das medições de calibração e armazene os valores obtidos.
nota: Os valores típicos para a configuração usada são ~ 8-10 kHz / molécula (MOL) para potência de excitação de 1,8 μW 488 nm. Valores mais baixos do que o normal podem indicar sujeira na objetiva, desalinhamento da configuração ou saída de laser reduzida. Verifique e armazene as potências de saída do laser na objetiva regularmente usando um medidor de potência. Para comparação de diferentes configurações, o brilho molecular normalizado pela potência do laser de excitação é o parâmetro mais significativo para avaliar o desempenho do microscópio.
4. Espectroscopia de correlação cruzada de fluorescência de varredura: aquisição
NOTA: O protocolo a seguir foi escrito para experimentos realizados com mEGFP/mEYFP ('verde') e mCherry/mCardinal ('vermelho') no microscópio confocal de varredura a laser usado neste estudo. A configuração óptica e as configurações do software (linhas de laser, espelhos dicróicos, filtros) podem ser diferentes para outros FPs ou configurações de microscópio.
- Configure o caminho óptico, por exemplo, excitação de 488 nm e 561 nm e um espelho dicróico de 488/561 nm, orifício em 1 UA para excitação de 488 nm. Para evitar diafonia espectral, selecione duas faixas separadas para excitar e detectar mEGFP / mEYFP (excitação de 488 nm, canal verde) e mCherry / mCardinal (excitação de 561 nm, canal vermelho) sequencialmente e selecione as faixas de comutação a cada linha. Para a detecção, use filtros apropriados para ambos os canais, por exemplo, 499-552 nm no canal verde e 570-695 nm no canal vermelho.
- Se a excitação alternada não for possível, use as configurações de filtro apropriadas para o canal vermelho para minimizar a diafonia espectral (ou seja, detectar a fluorescência mCherry/mCardinal não abaixo de 600 nm). Isso pode reduzir a quantidade de fótons detectados no canal vermelho e, assim, reduzir o SNR.
- Colocar o prato que contém as células misturadas no porta-amostras. Aguarde pelo menos 10 minutos para garantir o equilíbrio da temperatura e reduzir o desvio de foco.
- Concentre-se nas células usando a luz de transmissão no menu Localizar.
- Procure um par de células 'vermelhas' e 'verdes' em contato uma com a outra. Para o controle de correlação cruzada positiva ou brilho do homodímero (ver seção 2), procure uma célula isolada emitindo fluorescência em ambos os canais ou o respectivo sinal do homodímero no PM.
NOTA: (Crítico) Minimize a exposição da amostra durante a busca de células para evitar o pré-branqueamento, o que pode reduzir a correlação cruzada. Portanto, digitalize na velocidade de varredura mais rápida e com baixa potência do laser. Para evitar a saturação do detector durante a geração de imagens de células que expressam fortemente, pesquise no modo de integração. No entanto, para minimizar a exposição, a varredura com potências de laser mais baixas é possível no modo de contagem de fótons.
- Selecione um caminho de varredura perpendicular ao contato célula-célula (ou ao PM de uma única célula para a correlação cruzada positiva ou controle de brilho homodímero) usando o botão Cortar conforme ilustrado nas Figuras 1B e 2A.
nota: Alguns microscópios mais antigos não permitem direções de varredura arbitrárias. Nesse caso, os contatos célula-célula com uma orientação perpendicular à direção da varredura devem ser localizados.
- Amplie para obter um tamanho de pixel de 50-200 nm e selecione Linha no modo de digitalização. Defina o tamanho do quadro como 128 × 1 pixels.
nota: O tamanho típico do pixel é de 160 nm, correspondendo a um comprimento de varredura de cerca de 20 μm.
- Defina a velocidade de varredura para o valor máximo permitido, por exemplo, 472,73 μs por linha.
nota: Para um esquema de excitação alternativo, isso corresponde a 954,45 μs de tempo de varredura, ou seja, ~ 1000 varreduras / s na configuração usada. A velocidade de varredura pode ser ajustada dependendo do coeficiente de difusão da proteína de interesse. Para proteínas ancoradas na membrana, os tempos de difusão típicos são de cerca de 10-20 ms. O tempo de varredura deve ser pelo menos dez vezes menor que os tempos de difusão. Velocidades de varredura mais baixas podem induzir fotobranqueamento mais forte e exigir poderes de iluminação mais baixos. Alternativamente, pode-se impor uma pausa, por exemplo, 5 ms, entre cada varredura para complexos de difusão muito lenta usando Intervalo no submenu Série Temporal.
- Escolha as potências de laser apropriadas, por exemplo, ~1-2 μW para 488 nm e ~5-10 μW para excitação de 561 nm.
nota: Potências de laser mais altas melhoram o SNR, mas aumentam o fotobranqueamento. Portanto, as potências do laser devem ser escolhidas de forma que o fotobranqueamento seja inferior a 50% da taxa de contagem inicial.
- Defina Ciclos como 100.000-500.000.
nota: O número de varreduras, ou seja, a duração da medição, pode variar: Tempos de medição mais longos melhorarão a SNR e podem ser mais apropriados para difundir lentamente as moléculas, no entanto, o movimento das células e o fotobranqueamento limitam o tempo máximo de medição. Os dados apresentados aqui foram adquiridos rotineiramente por ~ 3-6 min, ou seja, 200.000-400.000 varreduras de linha.
- Defina os detectores para o modo de contagem de fótons. Pressione Iniciar experimento para iniciar a aquisição. Repita as etapas 4.5-4.11 para medir outra célula.
nota: Recomenda-se medir 10-15 células por amostra em diferentes níveis de expressão. (Crítico) Evite a saturação do detector em altos níveis de expressão. A taxa máxima de contagem não deve exceder ~ 1 MHz.
- Se a análise de brilho for realizada para determinar estados oligoméricos, execute medições de calibração de brilho de homodímero de acordo com as etapas modificadas 4.1-4.11: Meça cada homodímero de proteína fluorescente separadamente (em células isoladas, preparadas usando a seção 2 do protocolo) e execute medições apenas em um canal espectral.
