Ensaio de imunoprecipitação para estudar interações de receptores enzimáticos em células transfectadas

Resumo

Fonte: Strazza, M., et al. Ensaio de co-imunoprecipitação para estudar interações funcionais entre receptores e enzimas. J. Vis. Exp. (2018).

Neste vídeo, demonstramos uma técnica para realizar a co-imunoprecipitação de proteínas PD-1 do tipo selvagem e mutantes marcadas com GFP usando esferas revestidas com anticorpos anti-GFP. As proteínas PD-1-GFP ligadas a grânulos são incubadas com proteínas SHP2 que interagem com PD-1, permitindo a identificação de motivos estruturais específicos em PD-1 que desempenham um papel crítico na interação SHP2.

Protocolo

1. Imunoprecipitação

NOTA: Os passos seguintes devem ser executados no gelo ou a 4 °C.

1. Suplemente o tampão de lise (50 mM Tris-HCl a pH 7,2, 250 mM NaCl, 0,1% NP-40, 2 mM EDTA, 10% glicerol) com inibidores de protease (dissolva 1 comprimido em 10 mL de tampão de lise) e com 1 mM de ortovanadato de sódio. Adicione 500 μL de tampão de lise gelada às células e remova e colete as células das placas imediatamente usando um raspador de células.
   nota: É importante adicionar o ortovanadato de sódio apenas ao tampão de lise que será usado para as placas transfectadas por PD-1-GFP, uma vez que as placas transfectadas por SHP2 e as placas de controle não transfectadas devem reter a atividade da fosfatase.
2. Transfira os lisados para tubos frios de 1,5 mL e gire-os a 0,005 x g, 4 ° C por 30 min.
3. Para coletar o sobrenadante pós-núcleo (PNS) dos lisados, gire os lisados por 10 min a 10.000 x g a 4 ° C e transfira os sobrenadantes para novos tubos. Descarte o pellet. Armazenar os sobrenadantes do segundo conjunto de seis placas (figura 1) em gelo para posterior análise do lisado de células inteiras.
4. Preparação dos grânulos anti-GFP para imunoprecipitação de PD-1-GFP a partir dos lisados transfectados de PD-1-GFP do primeiro conjunto (quatro placas) (Figura 1).
   1. Para evitar o assentamento das contas, agite suavemente a garrafa com as contas antes de abrir. Remova 40 μL dos grânulos anti-GFP da pasta para cada condição.
   2. Centrifugar a 500 x g durante 3 min a 4 °C e retirar o sobrenadante para lavar os grânulos.
      nota: É importante minimizar o contato entre as pontas plásticas da pipeta e os grânulos de agarose para evitar perdas. Recomenda-se cortar a borda de uma ponta de 200 μL antes de transferir os grânulos para outro tubo.
   3. Ressuspenda os grânulos em 80 μL de tampão de lise (por amostra).
5. Adicione os grânulos lavados diretamente ao lisado celular (PNS) das células que expressam PD-1-GFP do primeiro conjunto (quatro placas) (etapa 1.3). Gire a 0,005 x g por 30 min a 4 ° C para imunoprecipitar as proteínas marcadas com GFP.
6. Lave as esferas com 1 mL de tampão de lise fria (sem ortovanadato) 3 vezes. Centrifugar o tubo a 2.500 x g por 10 s.
   nota: Ao adicionar o tampão de lise às contas, adicione-o diretamente nas contas sem tocá-las com as pontas. Não há necessidade de pipetar para cima e para baixo durante as lavagens.
7. Da mesma forma, divida o lisado do SHP2 ativo do primeiro conjunto (uma placa; etapa 1.3) e adicione-o a três tubos dos grânulos contendo PD-1-GFP lavados (o WT PD-1-GFP e as duas mutações fosfodeficientes diferentes, Y223F e Y248F). Adicione um terço do volume do lisado das células não transfectadas ao segundo tubo das esferas WT PD-1-GFP. Descarte os dois terços restantes.
8. Incubar os grânulos durante 4 h a 4 °C com uma rotação suave (0,005 x g).
9. Lave as esferas duas vezes com 1 mL de tampão de lise fria (sem pervanadato ou ortovanadato), conforme relatado na etapa 1.6.
10. Adicionar 80 μL de tampão de lise (sem pervanadato ou ortovanadato) por amostra, garantindo que o volume total em cada tubo seja de 100 μL (20 μL de grânulos e 80 μL de tampão de lise). Misture delicadamente e transfira 50 μL de cada tubo para dois tubos novos de 1,5 mL.
    nota: Após esta etapa, haverá dois tubos preenchidos com uma mistura que contém grânulos e tampão de lise. Um dos tubos será utilizado para testar o SHP2 co-imunoprecipitado por western blotting.

2. Análise de Western Blot SHP2

1. Gire as contas e remova o sobrenadante.
2. Adicione 20 μL de tampão 2x Laemmli (consulte a Tabela de Materiais) aos grânulos e ferva a 95 °C por 5 min.
3. Meça a concentração de proteína dos controles de entrada (segundo conjunto) usando um kit BCA (consulte a Tabela de Materiais). Transferir 30 μL da amostra mais diluída para um novo tubo. Dilua o restante dos controles de entrada com tampão de lise para a mesma concentração da amostra mais diluída e transfira 30 μL de cada um deles para um novo tubo.
   nota: Após esta etapa, haverá 4 tubos com 30 μL cada, em concentrações proteicas semelhantes, representando os lisados de controle de entrada.
4. Adicione volumes iguais de tampão Laemmli 2x aos lisados e ferva a 95 ° C por 5 min. Gire os grânulos e carregue o sobrenadante em gel à base de SDS-PAGE Tris a 4–20% (consulte a Tabela de Materiais) para análise de western blot. Além disso, carregue 50 μL de cada amostra do segundo conjunto.
5. Continue com a análise de western blot.

Resultados

Figura 1: Condições experimentais e estratégia. GFP-PD-1 WT (tipo selvagem), GFP-PD-1 Y223F (mutante ITIM) ou GFP-PD-1 Y248F (mutante ITSM) foram expressos em células HEK 293T que foram posteriormente tratadas com pervanadato. As proteínas GFP-PD-1 fosforiladas coletadas por imunoprecipitação GFP foram misturadas com lisados de células superexpressando SHP2, e os níveis e a atividade de SHP2 ligado...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Membranas de nitrocelulose	General Electric	10600004
Microcentrífuga	Eppendorf	5424-R	1,5 mL
BCA	pescador	23225	Ensaio de ácido bi cinconínico
Anti-SHP2	Santa Cruz	SC-280
Anti-GFP-agarose	MBL	D153-8
Anti-GFP	Roche	118144600
Anti-Actina	Santa Cruz	SC-1616
Células HEK-293	ATCC	CRL-1573
Ortovanadato	sigma	S6508
Coquetel de inibidores de protease	Roche	11836170001	Sem EDTA
Tampão de amostra Tris-Glycine SDS (2x)	Invitrogen	LC2676	Tampão Laemmli modificado
4-20% Mini Géis de Tris-Glicina	Invitrogen	XP04205BOX	com 15 poços
Tripsina-EDTA (0,25%) Vermelho de fenol	Gibco	25200114
NaCl	sigma	S7653	cloreto de sódio