Método baseado em ELISA para analisar interações entre proteínas de isca e presa

Abstract

Fonte: Singh, B. et al., Ensaios para estudar o papel da vitronectina na adesão bacteriana e resistência sérica. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo descreve uma técnica baseada em ELISA que detecta interações proteína-proteína entre duas proteínas, medindo a ligação da segunda proteína à primeira proteína imobilizada. A segunda proteína ligada é detectada usando anticorpos específicos marcados com uma enzima, como a peroxidase de rábano.

Protocol

1. Análise ELISA da interação entre PH recombinante e Vn

OBSERVAÇÃO: os controles precisam ser incluídos para excluir a associação não específica. O fator H humano (HF) ou a proteína de ligação a C4b (C4BP) são usados como controles positivos e negativos, respectivamente.

1. Dilua cada uma das proteínas humanas (Vn, FH e C4BP) separadamente a 50 nM em Tris-HCl, pH 9,0 (tampão de revestimento). Dispense 100 μL de solução de proteína em cada poço de uma placa de microtitulação Polysorp. Feche as placas com a tampa e guarde-as a 4 °C durante a noite (16 h) para facilitar a imobilização da proteína nos poços das placas de microtitulação.
2. Descarte a solução da placa de microtitulação inclinando-a de cabeça para baixo sobre a pia e lave os poços três vezes com 300 μL de PBS/alvéolo. Bloqueie os poços revestidos por 1 h em RT com PBS contendo 2,5% (p / v) de BSA (PBS-BSA).
3. Após remover a solução de bloqueio, lave os poços três vezes com 300 μL de PBS contendo 0,05% (v/v) de Tween 20 (PBST) por poço. Adicione 100 μL de PH recombinante marcado com His a 50 nM a cada poço de amostra e incube por 1 h em RT. Nos poços controle, adicione apenas 100 μL de PBS-BSA.
   nota: O gene lph que codifica PH de Hif foi amplificado por PCR e clonado no vetor de expressão pET26b que adiciona uma marca 6× His no terminal C da proteína expressa. O vetor recombinante foi transformado em E. coli BL21(DE3) para expressão. A resina Ni-NTA foi usada para purificar a proteína recombinante.
4. Rejeitar a solução proteica e remover as proteínas não ligadas lavando os alvéolos três vezes com 300 μL de PBST por alvéolo. Adicione 100 μL de PBS-BSA contendo anti-His conjugados com peroxidase de rábano (HRP) (diluição 1:10.000) e incube por 1 h em RT.
5. Prepare a solução A a 20 mM dissolvendo a tetrametilbenzidina em uma solução de acetona a 5% e metanol a 45%. Para preparar a solução B, dissolva 19,2 g de ácido cítrico em 1.000 mL de H₂O, ajuste o pH para 4,25 adicionando KOH e, em seguida, adicione 230 μL de 30% de H₂O₂. Armazene as duas soluções no escuro na RT. Imediatamente antes de usar, misture 500 μL da solução B com 9,5 mL da solução A para preparar o reagente de detecção ELISA.
6. Lave os poços três vezes com 300 μL de PBST por poço e detecte complexos antígeno-anticorpo adicionando 100 μL de reagente de detecção ELISA a cada poço.
7. Adicione 50 μL de 1 M H₂SO₄ / poço para interromper a reação. Meça a densidade óptica dos poços a 450 nm usando um leitor de microplacas.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sensores AR2G	Pall Ciências da Vida	18-5095	Sensor para proteína imobilizada por acoplamento de aminoácidos
acetona	VWR	Rolamento 97064-786	Grau de análise
Albuminas de soro bovino (BSA)	Sigma-Aldrich	A2058	Adequado para cultura de células
C4BP (proteína de ligação a C4b)	Complement Technology, Inc.	A109	Comprado como forma líquida congelada
ácido cítrico	Sigma-Aldrich	251275-500G	Grau da American Chemical Society (ACS)
Anticorpos anti-His marcados conjugados com HRP	Abcam	AB1269	Policlonal
C4BP	Complement Technology, Inc.	A109	Solução congelada
Coluna de resina de afinidade de histidina (HisTrap HP)	Ciências da Vida da GE Health Care	17-5247-01	Colunas pré-embaladas com Ni Sepharose
PH marcado com His			Recombinantemente expresso e purificado em nosso laboratório
Methano	VWR	BDH1135-1LP	Grau de análise
Plasmídeo contendo C-terminal 6x His-tag no backbone (pET26(b))	Novagen	Nº 69862-3	Vetor de DNA
Placas de microtítulo de polissorb	Sigma-Aldrich	M9410	Para ELISA
Tetrametilbenzidina	Sigma-Aldrich	860336-100MG	Grau ELISA
Vitronectina (Vn) do plasma humano	Sigma-Aldrich	Rolamento V8379-50UG	Grau de cultura celular