Ensaio de biossensor condutimétrico baseado em β-lactamase para interações proteína-proteína

Resumo

Fonte: Vandevenne, M., et al. O uso de um ensaio de biossensor condutimétrico baseado em β-lactamase para detectar interações biomoleculares. J. Vis. (2018)

Este vídeo demonstra um ensaio de biossensor condutimétrico para estudar a interação de um anticorpo com um antígeno alvo imobilizado em um chip transdutor. O biossensor é projetado para ter uma proteína quimérica bifuncional - uma enzima β-lactamase com um sítio catalítico funcional fundido a um nanocorpo para se ligar ao antígeno alvo imobilizado. Após a ligação, a hidrólise catalítica de um substrato antibiótico pela enzima β-lactamase gera um sinal elétrico - confirmando a interação antígeno-anticorpo.

Protocolo

1. Preparação de Amostra de Proteína

1. Produza e purifique a proteína híbrida BlaP-cAb-Lys3 conforme relatado em nosso estudo anterior. Armazenar a proteína em tampão fosfato 50 mM pH 7,4 com a seguinte composição: 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na₂HPO₄ e 0,24 g de KH₂PO₄ dissolvido em 800 mL de água destilada Fixar o pH da solução para 7,4 antes de ajustar o volume final da solução para 1 L. Filtrar a solução proteica.
2. Prepare uma solução estoque de lisozima de clara de ovo de galinha (HEWL). Dissolva 100 mg (40.000 unidades/mg) de HEWL comprado comercialmente em 10 mL de solução salina tampão fosf....

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagentes
KH2PO4	Sigma-Aldrich	V000225
K2HPO4	Sigma-Aldrich	1551128
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
Tris-HCl	Roche	10812846001
Edta	Sigma-Aldrich	E9884
Kcl	Sigma-Aldrich	Pág. 9541
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	NIST2186II
2-mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M6250
alanina	Sigma-Aldrich	Rolamento A7627
HClO4	Fluka	Rolamento 34288	Solução 1M HClO4, distribuidor: Sigma-Aldrich
Hidrolisado de caseína	Sigma-Aldrich	22090
Benzilpenicilina sódica	Sigma-Aldrich	B0900000
Lisozima de clara de ovo de galinha	Roche	10837059001
Heptano	Sigma-Aldrich	246654
metanol	Sigma-Aldrich	322415
Solução de hidróxido de amônio	Sigma-Aldrich	380539	28% de NH3 em H2O, purificado por dupla destilação (concentrado?)
Consumíveis de laboratório
Placa de 6 poços	Greiner Bio-One	657165	Placa de 6 poços CELLSTAR
equipamento
Medidor de pH	WTW	1AA110	Medidor de pH de laboratório inoLab pH 7110
Sistema de vácuo e filtragem	Nalgene	NALG300-4100	Porta-filtros com receptor, distribuidor : VWR
Chips de sensores potenciométricos			fabricado por Yunus e colegas (ref 16)
PGSTAT30 Autolab	Metrohm Autolab		descontinuado, sucessor Autolab PGSTAT302N
Multímetro digital, METRAHit 22M	Gossen Metrawatt		descontinuado, sucessor Metrahit Base