Ensaio de biossensor condutimétrico baseado em β-lactamase para interações proteína-proteína

Resumo

Fonte: Vandevenne, M., et al. O uso de um ensaio de biossensor condutimétrico baseado em β-lactamase para detectar interações biomoleculares. J. Vis. (2018)

Este vídeo demonstra um ensaio de biossensor condutimétrico para estudar a interação de um anticorpo com um antígeno alvo imobilizado em um chip transdutor. O biossensor é projetado para ter uma proteína quimérica bifuncional - uma enzima β-lactamase com um sítio catalítico funcional fundido a um nanocorpo para se ligar ao antígeno alvo imobilizado. Após a ligação, a hidrólise catalítica de um substrato antibiótico pela enzima β-lactamase gera um sinal elétrico - confirmando a interação antígeno-anticorpo.

Protocolo

1. Preparação de Amostra de Proteína

1. Produza e purifique a proteína híbrida BlaP-cAb-Lys3 conforme relatado em nosso estudo anterior. Armazenar a proteína em tampão fosfato 50 mM pH 7,4 com a seguinte composição: 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na₂HPO₄ e 0,24 g de KH₂PO₄ dissolvido em 800 mL de água destilada Fixar o pH da solução para 7,4 antes de ajustar o volume final da solução para 1 L. Filtrar a solução proteica.
2. Prepare uma solução estoque de lisozima de clara de ovo de galinha (HEWL). Dissolva 100 mg (40.000 unidades/mg) de HEWL comprado comercialmente em 10 mL de solução salina tampão fosfato (PBS, ver etapa 2.1.1). Esterilizar a solução proteica por filtração utilizando filtros com um corte de 0,22 μm.

2. Ensaios de biossensores

1. Preparação da solução e do tampão
   1. Prepare 50 mM PBS dissolvendo 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na₂HPO₄ e 0,24 g de KH₂PO₄ em 800 mL de água destilada. Ajustar para pH 7,4 com 1 N HCl ou 1 N NaOH antes de ajustar o volume da solução para 1 L. Filtrar e conservar a 4 °C.
   2. Preparar uma solução de saturação/bloqueio dissolvendo 3 g de hidrolisado de caseína em 100 ml de PBS preparado como descrito acima (ver passo 2.1.1). Filtrar, esterilizar e conservar a 4 °C.
   3. Prepare uma solução de ligação dissolvendo 1 g de hidrolisado de caseína em 100 mL de PBS preparado conforme descrito acima (consulte a etapa 2.1.1). Filtrar, esterilizar e conservar a 4 °C.
   4. Prepare uma solução de lavagem (0,1% Tween - PBS) adicionando 100 μL de Tween 20 (100%) em 100 mL de PBS preparado conforme descrito acima (consulte a etapa 2.1.1). Conservar a 4 °C.
   5. Prepare uma solução de preparação de eletrodo (1% Triton X-100 - PBS) adicionando 1 mL de Triton X-100 (100%) em 100 mL de PBS preparado conforme descrito acima (consulte a etapa 2.1.1). Conservar a 4 °C.
   6. Preparar uma solução de regeneração de eléctrodos (KCl 3,5 M) dissolvendo 26 g de KCl em água destilada até um volume final de 100 ml. Filtrar esterilizado e conservar a 4 °C.
   7. Preparar uma solução de NaCl a 5 mM dissolvendo 0,29 g de NaCl em água destilada até obter um volume final de 1 l. Filtrar, esterilizar e conservar a 4 °C. Em seguida, prepare uma solução de detecção (4 mM de benzilpenicilina) dissolvendo 26,7 mg de benzilpenicilina em 20 mL de solução de 5 mM de NaCl. Filtre, esterilize e armazene a -20 °C.
2. Preparação e regeneração de sensores
   nota: Os chips sensores revestidos com polianilina foram desenvolvidos e gentilmente fornecidos pelo Dr. P. Bogaerts, Dr. S. Yunus e Prof. Y. Glupczynski (Universidade Católica de Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne). A descrição do sensor, bem como os protocolos de eletropolimerização de polianilina usados para sintetizar esses sensores, são detalhados em seus trabalhos anteriores. Resumidamente, este sistema usa sensores reutilizáveis de oito chips individuais que foram fabricados por técnicas clássicas de placa de circuito impresso (PCB). Os chips individuais são compostos por três pontos redondos de eletrodos. O superior é o eletrodo de trabalho no qual a polianilina foi eletrossintetizada. O do meio é o eletrodo de referência e o eletrodo inferior constitui o contra-eletrodo. Tanto o eletrodo de referência quanto o contra-eletrodo são funcionalizados usando amálgama sólido de Ag/AgCl no topo da camada de carbono.
   1. Realize 3 lavagens dos eletrodos mergulhando as pontas em poços de uma placa de 96 poços contendo 300 μL/poço de solução de preparação de eletrodo (Triton X-100 a 1% - PBS, consulte a etapa 2.1.5.). Realize cada lavagem por 2 min com mistura suave em temperatura ambiente.
   2. Enxágue os eletrodos mergulhando as pontas em poços de uma placa de 96 poços contendo 300 μL/poço de água destilada por 2 min com mistura suave em temperatura ambiente.
   3. Regenere os eletrodos mergulhando as pontas em poços de uma placa de 96 poços contendo 300 μL / poço de solução de regeneração (3,5 M KCl, consulte a etapa 2.1.6) durante a noite a 4 ° C ou 1 h à temperatura ambiente.
   4. Realize 3 lavagens dos eletrodos mergulhando as pontas em poços de uma placa de 96 poços contendo 300 μL / poço de solução salina tampão fosfato (consulte a etapa 2.1.1.). Realize cada lavagem por 2 minutos com mistura suave em temperatura ambiente.
3. Ensaio de ligação realizado no sensor
   1. Cubra o HEWL na superfície PANI (polianilina) do eletrodo depositando uma gota de 15 μL de 40 μg / mL HEWL preparado em PBS na superfície do eletrodo. Incubar durante a noite a 4 °C ou 1 hora à temperatura ambiente.
   2. Realize três lavagens dos eletrodos com solução salina tampão fosfato (consulte a etapa 2.1.1) mergulhando as partes dos eletrodos dos chips sensores em poços de uma placa de 96 poços contendo 300 μL / poço de solução salina tampão fosfato. Realize cada lavagem por 2 min com mistura suave em temperatura ambiente.
   3. Sature os eletrodos adicionando uma gota de 50 μL da solução de bloqueio (consulte a etapa 2.1.2) na superfície do eletrodo. Incubar durante 1 h à temperatura ambiente. Em seguida, lave três vezes conforme descrito na etapa anterior (consulte a etapa 2.3.2).
   4. Diluir a solução de BlaP-cAb-Lys3 a 20 μg/ml em solução de ligação (ver passo 2.1.3) e aplicar uma gota de 15 μl desta solução diluída nos eléctrodos. Incube por 10 min em temperatura ambiente. Após a reação antígeno-nanocorpo, lave três vezes conforme descrito na etapa anterior usando a solução de lavagem (consulte a etapa 2.1.4). Em seguida, enxágue o eletrodo uma vez com PBS (consulte a etapa 2.1.1).
   5. Para detecção, conecte o chip do sensor através da parte do circuito de cobre em um multímetro digital. Em seguida, inicie a resposta do sensor aplicando uma gota de 50 μL de solução de detecção (consulte a etapa 2.1.7) nos eletrodos positivos e aplicando uma gota de 50 μL de solução de NaCl 5 mM nos eletrodos negativos (consulte a etapa 2.1.7). Incubar por 30 min em temperatura ambiente. Monitore a condutância com um multímetro digital.
      nota: O multímetro foi fornecido pelo Dr. P. Bogaerts, Dr. S. Yunus e Prof. Y. Glupczynski (Universidade Católica de Louvain-la-Neuve - CHU Mont-Godinne. Este potenciostato é controlado por computador através de uma porta USB e analisa os oito chips diferentes do sensor simultaneamente. O software criado por Yunus e colegas cria um gráfico em tempo real que representa as medições da diferença de condutância entre os eletrodos de referência e de amostra em relação ao tempo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Reagentes
KH2PO4	Sigma-Aldrich	V000225
K2HPO4	Sigma-Aldrich	1551128
NaCl	Sigma-Aldrich	S7653
Tris-HCl	Roche	10812846001
Edta	Sigma-Aldrich	E9884
Kcl	Sigma-Aldrich	Pág. 9541
Na2HPO4	Sigma-Aldrich	NIST2186II
2-mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M6250
alanina	Sigma-Aldrich	Rolamento A7627
HClO4	Fluka	Rolamento 34288	Solução 1M HClO4, distribuidor: Sigma-Aldrich
Hidrolisado de caseína	Sigma-Aldrich	22090
Benzilpenicilina sódica	Sigma-Aldrich	B0900000
Lisozima de clara de ovo de galinha	Roche	10837059001
Heptano	Sigma-Aldrich	246654
metanol	Sigma-Aldrich	322415
Solução de hidróxido de amônio	Sigma-Aldrich	380539	28% de NH3 em H2O, purificado por dupla destilação (concentrado?)
Consumíveis de laboratório
Placa de 6 poços	Greiner Bio-One	657165	Placa de 6 poços CELLSTAR
equipamento
Medidor de pH	WTW	1AA110	Medidor de pH de laboratório inoLab pH 7110
Sistema de vácuo e filtragem	Nalgene	NALG300-4100	Porta-filtros com receptor, distribuidor : VWR
Chips de sensores potenciométricos			fabricado por Yunus e colegas (ref 16)
PGSTAT30 Autolab	Metrohm Autolab		descontinuado, sucessor Autolab PGSTAT302N
Multímetro digital, METRAHit 22M	Gossen Metrawatt		descontinuado, sucessor Metrahit Base