Sonda de peptídeo penetrante de células biotiniladas para detectar interações proteína-proteína

Resumo

Fonte: Jaraíz-Rodríguez, M. et al., Peptídeos de penetração celular biotinilada para estudar interações proteína-proteína intracelular. J. Vis. Exp. (2017).

Este vídeo demonstra uma técnica que usa peptídeos de penetração de células biotiniladas para detectar interações proteína-proteína intracelular. Os peptídeos que penetram nas células facilitam a entrada do peptídeo conjugado em uma célula e se ligam especificamente às suas proteínas de interação. A biotina, após se ligar à avidina, permite a purificação do complexo de proteínas que interagem a partir de um lisado celular.

Protocolo

1. Células

1. Dois dias antes de iniciar o procedimento, plaquear as células na densidade necessária para serem confluentes no dia do experimento. Coloque as células em frascos ou placas. No entanto, a extração de proteínas será mais fácil a partir de placas. É conveniente preparar pelo menos 4 placas de 78 cm² ou 2 frascos de 150 cm² por condição por experiência, para ter a certeza de que os resultados são consistentes.
2. Neste estudo, placas de GSCs G166 humanas em 4 frascos de 150 cm², cultivadas em meio de células-tronco RHB-A suplementado com 2% de B27, 1% de N2, 20 ng/mL de EGF e b-FGF, conforme descrito por Pollard et al. Processo quando a confluência foi alcançada. Por exemplo, quando 5 x 10⁶ células G166 foram semeadas em um frasco de 150 cm², elas foram processadas 2 dias após o plaqueamento.

2. CPPs biotiniladas

1. Gire os frascos contendo os CPPs biotinilados liofilizados (BCPPs) a 8200 x g por 30 s, para evitar que parte do pó permaneça na tampa. Inclua um BCPP de controle para garantir que as interações encontradas sejam específicas para a sequência de destino. Neste estudo, o BCPP controle foi TATbiotina (TAT-B), e o BCPP de tratamento foi TAT-Cx43_266-283-B. Outros controles podem ser usados, como TAT fundido a fragmentos embaralhados ou mutantes ligados à biotina.
2. Dissolver os BCPPs no meio de cultura correspondente à solução-mãe indicada pelo fabricante; por exemplo, para obter uma solução-mãe de 2 mg/ml de BCPP para tratar os GSC, adicionar 0,5 ml de meio de cultura GSC a um frasco para injetáveis contendo 1 mg de BCPP. Vortex e certifique-se de que o peptídeo esteja bem dissolvido.

3. Tubos

NOTA: Prepare pelo menos doze tubos de 1.5 mL por condição exigida na Seção

1. Marque os primeiros 3 tubos por condição. Eles terão o volume total de lisados celulares obtidos na etapa 6.4.
2. Marque um A em 3 tubos por condição. Esses tubos terão os primeiros sobrenadantes obtidos após a lisagem e rotação dos lisados celulares, etapa 7.2.
3. Marque um B em 3 tubos por condição. Esses tubos terão uma pequena alíquota dos primeiros sobrenadantes. Esses lisados servirão como amostras de Western blot na etapa 7.3.
4. Marque um C em 3 tubos por condição. Esses tubos terão os sobrenadantes obtidos após o pull-down com NeutrAvidina, passo 7.7.
   nota: Isso é importante caso o Western blot não mostre sinal para proteínas, o que significa que as proteínas não foram puxadas para baixo ou foram perdidas em alguma etapa do procedimento. Se for essa a situação, repita o processo para reduzir as proteínas.

4. Tratamento celular com os BCPPs

1. Aspire o meio de cultura.
2. Substituir o volume correspondente de meio fresco necessário para incubar os BCPPs no menor volume possível de meio, de acordo com os tempos de incubação. É muito importante que, em qualquer caso, o meio cubra completamente toda a superfície da placa/frasco para que as células não sequem, por exemplo, 6 mL por 150 cm² para uma incubação de 30 minutos.
3. Adicione o volume da solução-mãe de BCPP às culturas de células para atingir a concentração comprovadamente eficaz. Neste estudo, foi comprovado que 50 μM TAT-Cx43266-283-B reduz a proliferação de GSC.
   1. Portanto, adicione 92,8 μL de 2 mg / mL TAT-Cx43_266-283-B (MW = 3723,34 g / mol) por mL de meio de cultura para obter uma concentração final de 50 μM TAT-Cx43_266-283-B. Se o volume a ser adicionado for diferente para os peptídeos de controle, complete com meio de cultura até o mesmo volume final. Por exemplo, 49,1 μL TAT-B (MW=1914,31 g/mol) mais 43,7 μL de meio GSC foram adicionados por mL de meio de cultura para obter uma concentração final de 50 μM TAT-B.
4. Coloque as células na incubadora a 37 °C e 5% de CO₂ por 30 min para garantir que as interações entre o BCPP e seus parceiros intracelulares ocorram. Se a interação demorar mais, incubar por tempos mais longos ou ajustar os tempos caso o experimento consista em um curso de tempo. Além disso, a interação de interesse pode ser promovida ou prevenida estimulando diferentes vias de sinalização intracelular.

5. Buffers e soluções

1. Prepare PBS pH 7,4: 136 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 7,8 mM Na₂HPO₄·2H₂O; 1,7 mM KH₂PO₄.
2. Prepare o tampão de lise de proteína: 20 mM Tris-HCl (pH 8,0), 137 mM NaCl, 1% IGEPAL, Antes de usar, adicione o seguinte: 1/100 (v / v) Coquetel Inibidor de Protease, 1 mM de Fluoreto de Sódio, 1 mM de Fluoreto de Fenilmetanossulfonil (PMSF) e 0,1 mM de ortovanadato de sódio.
3. Prepare o tampão Laemmli: (4x: 0,18 M Tris-HCl pH 6,8; 5 M de glicerol; 3,7% SDS (p/v); 0,6 M β-mercaptoetanol ou 9 mM DTT; 0,04% (v/v) de azul de bromofenol (BB)).

6. Extração de proteínas

NOTA: A extração de proteínas foi realizada conforme descrito anteriormente. Efectuar toda esta secção do procedimento a 4 °C.

1. Aspirar completamente o meio de cultura.
2. Lave 3 x 10 mL com solução salina tamponada com fosfato gelado (PBS) por 150 cm² com muito cuidado para evitar o descolamento celular.
3. Para obter o lisado celular, adicione 3 mL de tampão de lise por 150 cm² e raspe bem a superfície usando um raspador de células. Inclinar a placa/frasco a cerca de 45 graus facilitará a coleta dos lisados celulares em seus tubos correspondentes.
4. Despeje 1 mL do lisado celular por tubo em três tubos de 1,5 mL. Esses tubos serão marcados com a condição e a réplica conforme indicado na etapa 3.1.

7. Suspenso

1. Centrifugue os tubos de 1,5 mL a 11.000 x g por 10 min a 4 °C.
2. Transferir os sobrenadantes para novos tubos (A).
3. Tirar uma alíquota deste sobrenadante por condição para diferentes tubos (B), ou seja, 50 μL por tubo. Adicione 4x tampão Laemmli (16,6 μL para 50 μL de lisado) e congele a -20 °C. Esses lisados servirão como amostras usuais de Western blot.
4. Homogeneizar muito bem a NeutrAvidina Agarose agitando suavemente. Corte as pontas das pontas da pipeta para aumentar seu diâmetro e melhorar a pipetagem das contas. Adicione 50 μL de NeutrAvidina Agarose por mL de lisado celular nos tubos (A).
5. Incubar a 4 °C durante a noite com agitação muito suave para permitir que a NeutrAvidina interaja com os BCPPs ligados aos seus parceiros intracelulares.
6. Centrifugue a 3.000 x g por 1 min a 4 ° C para coletar o complexo de NeutrAvidina com proteínas.
7. Remova cuidadosamente os sobrenadantes e transfira-os para tubos limpos (C). Guarde-os para usá-los caso o pull-down não seja bem-sucedido.
8. Etapas de lavagem: adicione tampão de lise fresco aos pellets (tubos A), ressuspenda por inversão e repita as etapas 7.6 e 7.7 mais cinco vezes. Todos esses sobrenadantes podem ser descartados.
9. Remova os sobrenadantes e adicione 2x tampão Laemmli ao volume final desejado (40 μL por tubo de 1,5 mL para pellets obtidos de frascos de cm² de células confluentes).
10. Eluir a 100 °C por 5 min para dissociar as interações entre as proteínas e centrifugar por 30 s a 8.200 x g para granular grânulos de NeutrAvidina.
11. Levar os sobrenadantes, contendo as proteínas dissociadas, com pontas capilares para novos tubos (D). As contas podem ser mantidas caso seja necessária a repetição de etapas de eluição.
    nota: Os sobrenadantes (tubos D) estão agora prontos para serem carregados em Western blot ou para congelar a -20 °C.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Linha G166 GSC	Representante biológico
Meio de células-tronco RHB-A	Takara	Y40001
Proteína de Laminina de Camundongo	Invitrogen, Tecnologias de Vida, ThermoFisher Scientific	Rolamento 23017-015	10 μg/ml
Suplemento sem soro B-27 (50X)	Invitrogen, Tecnologias de Vida, ThermoFisher Scientific	Rolamento 17504-044	2% de sucesso
Suplemento N-2 (100x)	Invitrogen, Tecnologias de Vida, ThermoFisher Scientific	17502-048	1% de sucesso
EGF humano recombinante	Peprotech	AF-100-15	20 ng/ml
b-FGF humano recombinante	Peprotech	AF-100-18B	20 ng/ml
PBS pH 7,4: Em água deionizada, 136 mM NaCl; 2,7 mM KCl; 7,8 mM Na2HPO4·2H2O; 1,7 mM KH2PO4
Tat	GenScript		sob medida
TAT-B	GenScript		sob medida
TAT-CX43266-283	GenScript		sob medida
TAT-Cx43266-283-B	GenScript		sob medida
Pierce™ NeutrAvidina™ Agarose	ThermoFisher Scientific	29200
Tampão de lise de proteína: 5 mM Tris HCl (pH 6,8), 2% (p / v) SDS, 2 mM EDTA, 2 mM EGTA
Fluoreto de sódio	PanReac AppliChem	141675	1 mM
Fluoreto de fenilmetanossulfonilo (PMSF)	Sigma-Aldrich	Pág. 7626	1 mM
Ortovanadato de sódio	Sigma-Aldrich	S6508	0,1 mM
Tampão Laemmli: (4x: 0,18 M Tris-HCl pH 6,8; 5 M de glicerol; 3,7% (p / v) SDS; 0,6 M β-mercaptoetanol ou 9 mM DTT; 0,04% (v / v) azul de bromofenol (BB) .