1. Transformação de levedura
- Colha o fermento por centrifugação (em tubos de 50 ml) a 1.500 x g por 5 min em RT. Descarte o sobrenadante, ressuspenda cada pellet em 5 ml de H2O estéril e agrupe.
- Centrifugue novamente a 1.500 x g por 5 min em RT e descarte o sobrenadante. Ressuspenda o pellet de levedura em 1 ml de 1x LiAc/TE.
estéril recém-preparado
nota: Use células de levedura competentes dentro de 1 hora após a preparação.
- Prepare amostras de plasmídeo (em tubos de 1,5 ml) adicionando 200 ng de DNA de plasmídeo para transformações únicas, ou 0,5 - 1 μg de cada DNA de plasmídeo para co-transformações, e 100 μg de DNA transportador de testículos de arenque (fervido por 20 min e resfriado em gelo antes do uso).
NOTA: Inclua um controle positivo, por exemplo, levedura cotransformada com pVA3 (codificando para fusão GAL4 DNA-BD com proteína p53) e pTD1 (codificando para fusão GAL4 AD com antígeno T grande SV40).
- Adicione 100 μl da suspensão de levedura competente recém-preparada e 600 μl de 1x solução LiAc/PEG (8 ml de estoque PEG 3350, 1 ml de estoque TE, 1 ml de estoque LiAc) e vórtice por ~ 30 segundos. Incube a 30 ° C por 30 min com agitação a 200 rpm.
- Adicionar 80 μl de dimetilsulfóxido (concentração final de 10% v/v) e misturar bem por inversão suave. Choque térmico por 15 min em banho-maria a 42 °C enquanto mistura a cada 2 - 3 min.
- Resfrie a suspensão celular no gelo por 2 min e centrifugue a 14.000 x g por 15 segundos em RT para recuperar o fermento.
- Ressuspenda o pellet celular em 100 μl de 1x TE e coloque em placas médias SD mínimas apropriadas para crescimento seletivo (meio sem leucina e triptofano para manter a pressão seletiva nos plasmídeos da isca e do alvo).
- Incubar as placas de cabeça para baixo a 30 °C até que as colônias tenham ~ 2 mm de diâmetro (geralmente 4 a 5 dias). As placas podem ser armazenadas a 4 °C por 2 a 3 semanas; para armazenamento mais longo, faça estoques de glicerol e armazene a -80 °C.
nota: Verifique se as proteínas isca e alvo são expressas na levedura por immunoblotting e se não têm ativação autônoma do gene repórter quando expressas separadamente na levedura.
- Adicione 100 μl da suspensão de levedura competente recém-preparada e 600 μl de 1x solução LiAc/PEG (8 ml de estoque PEG 3350, 1 ml de estoque TE, 1 ml de estoque LiAc) e vórtice por ~ 30 segundos. Incube a 30 ° C por 30 min com agitação a 200 rpm.
- Adicionar 80 μl de dimetilsulfóxido (concentração final de 10% v/v) e misturar bem por inversão suave. Choque térmico por 15 min em banho-maria a 42 °C enquanto mistura a cada 2 - 3 min.
- Resfrie a suspensão celular no gelo por 2 min e centrifugue a 14.000 x g por 15 segundos em RT para recuperar o fermento.
- Ressuspenda o pellet celular em 100 μl de 1x TE e coloque em placas médias SD mínimas apropriadas para crescimento seletivo (meio sem leucina e triptofano para manter a pressão seletiva nos plasmídeos da isca e do alvo).
- Incubar as placas de cabeça para baixo a 30 °C até que as colônias tenham ~ 2 mm de diâmetro (geralmente 4 a 5 dias). As placas podem ser armazenadas a 4 °C por 2 a 3 semanas; para armazenamento mais longo, faça estoques de glicerol e armazene a -80 °C.
NOTA: Verifique se as proteínas isca e alvo são expressas na levedura por immunoblotting e se não têm ativação autônoma do gene repórter quando expressas separadamente na levedura.
2. Ensaio de β-gal de papel de filtro de elevação de colônia
- Prepare os seguintes buffers:
- Prepare um tampão Z contendo 100 mM de Na2HPO4, 40 mM de NaH2PO4, 10 mM de KCl e 1 mM de MgSO4; ajuste o pH para 7,4. Esterilize por autoclavagem e armazene em RT.
- Preparar tampão X-Gal dissolvendo 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosídeo a 20 mg/ml em N,N-dimetilformamida e conservar à escura a -20 °C. Preparar tampão Z/solução X-Gal. Faça tampão antes de usar misturando X-Gal a 0,33 mg / ml e β-mercaptoetanol a 0,27% v / v no tampão Z. Use 2,5 ml por amostra.
- Adicionar 2,5 ml de solução de tampão Z/X-Gal recentemente preparada a uma placa limpa de 100 mm e colocá-la dentro de um papel de filtro de celulose.
- Coloque um novo papel de filtro sobre a superfície da placa com as colônias de levedura a serem analisadas. Esfregue suavemente o papel de filtro na placa com uma pinça e deixe por ~ 5 min para que as colônias se prendam.
nota: Processar o controle positivo em paralelo, ou seja, levedura cotransformada com pVA3 e pTD1.
- Levante o papel de filtro e mergulhe-o (com uma pinça) em uma poça de nitrogênio líquido por 30 segundos (o nitrogênio líquido deve ser manuseado com cuidado; sempre use luvas grossas e óculos de proteção). Deixe o papel de filtro congelado descongelar em RT por ~ 2 min.
- Colocar o papel de filtro (com a colónia para cima) por cima do papel de filtro pré-embebido no interior da placa de 100 mm e incubar a 30 °C.
- Verifique periodicamente (a cada ~30 min) o aparecimento de colônias azuis.
nota: Isca fraca: as interações do alvo podem levar várias horas para produzir um sinal azul positivo (evite incubação prolongada (>8 horas) que pode dar resultados falsos positivos). Para obter melhores resultados, use colônias recém-cotransformadas, ou seja, cultivadas a 30 ° C por 4 a 5 dias, ~ 2 mm de diâmetro.
