1. Células de revestimento
- Um dia antes da transfecção, coloque 3,5 x 106 HEK293T células em 10 mL de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) suplementado com 10% (v / v) de soro fetal bovino (FBS) e 1% (v / v) de penicilina / estreptomicina (estoque de 10.000 U / ml) por placa de 100 mm. Placa 3 - 5 100 mm2 placas por experimento/condição para garantir recuperação proteica suficiente.
nota: O número de placas deve ser determinado para cada experimento/condição, que dependerá dos níveis de expressão e solubilidade do complexo proteico de interesse. Alternativamente, se for necessária purificação em larga escala, as linhagens celulares podem ser adaptadas para crescer em suspensões em frascos giratórios, mas esse método não funcionará para transfecções transitórias.
2. Transfecção de células ou indução de linhagens celulares estáveis
- No dia seguinte, verifique as células ao microscópio. As células devem ser 70 - 80% confluentes antes de prosseguir.
- Transfectar as células com uma mistura total de 7 μg de DNA plasmidial e 21 μl de reagente de transfecção por placa de 100 mm. Células transfectadas com vetor expressando GFP (Tabela 1) como controle para a eficiência da transfecção.
nota: Se estiver usando um HEK293-T-REx ou uma linhagem celular estável semelhante que induza a expressão de duas ou mais subunidades complexas em resposta à doxiciclina, o indutor terá que ser adicionado às células e incubado por 48 horas. Da mesma forma, uma linhagem celular estável que induza a expressão de GFP após a adição do indutor também seria necessária para fins de validação. Prossiga para a etapa 2.7.
- Preparar a mistura de transfecção por cápsula de 100 mm. Num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, misturar 500 μl de DMEM não suplementado com 7 μg de ADN plasmídico total (correspondendo a dois ou mais plasmídeos). Em um tubo de microcentrífuga separado, misture 500 μl de DMEM não suplementado com 21 μl do reagente de transfecção. Repita para cada reação de transfecção.
- Pipetar a solução de reagente de transfecção para a solução de ADN plasmidial (não misturar as soluções pela ordem inversa). Misture pipetando pelo menos 4 vezes.
- Incube esta mistura em temperatura ambiente por 10 a 15 min, mas não mais do que 15 min.
- Incline a placa para criar um reservatório de mídia e pipete cuidadosamente a mistura de transfecção gota a gota para o lado interno da placa sem perturbar as células. Retorne o prato à sua posição plana original e gire suavemente para distribuir a mistura.
- Incubar as células a 37 °C em uma incubadora de cultura de células umidificada com 5% de CO2 (esta condição é doravante denominada "incubadora de cultura de tecidos"). Substitua o meio 5 horas após a transfecção (opcional).
3. Verificando a eficiência de transfecção ou indução
- Às 24 horas após a transfecção, visualize as células sob um microscópio fluorescente para verificar a eficiência da transfecção (ou indução de linha celular estável HEK293T-REx de controle expressando GFP). Incube por mais 24 horas.
4. Purificação de afinidade STREP (STREP AP)
- Coletando as células
- Às 48 horas após a transfecção, remova o meio e adicione 8 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS) fria. Pipete para cima e para baixo para separar as células da placa.
- Colete e transfira a suspensão celular para um tubo de 15 mL e gire as células para baixo a 800 x g por 4 min a 4 ° C.
- Remova o sobrenadante PBS. Repita a rotação para baixo (800 x g por 1 min a 4 ° C) para eliminar qualquer PBS residual. Conservar o sedimento celular a -80 °C para utilização futura ou seguir o procedimento abaixo para continuar a purificação das proteínas.
- Lisando as células
- Ressuspenda os grânulos celulares usando 5× o volume do grânulo celular (~ 250 μl por placa) do tampão de lise passiva (PLB: 20 mM Tris-HCl pH 7,5, 150 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM DTT, comprimido de coquetel inibidor de protease, 5% v / v glicerol e 1,0% NP-40) e transfira a suspensão celular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
- Agitar brevemente a suspensão e o nutato durante 30 min a 4 °C.
- Gire a suspensão celular a 10.000 x g por 10 min a 4 °C.
- Transferir os lisados solúveis para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e rejeitar os sedimentos celulares. Guarde 10% do volume final do lisado solúvel como "STREP AP Input". Armazene a 4 °C.
- Equilibrando as contas STREP
nota: Use contas STREP para a primeira etapa AP! Os complexos puxados para baixo com grânulos STREP recuperam significativamente mais proteína do que aqueles puxados para baixo com grânulos FLAG.
- Retirar (n × 40 μl) + n μl da pasta de esferas STREP a 50% (n = número de amostras) e girar a 1.500 x g por 2 min a 4 ° C.
NOTA: Use pontas de boca larga para pipetar contas.
- Remova o sobrenadante e adicione 500 μl de PLB aos grânulos. Nute a mistura de grânulos por 5 min a 4 ° C. Gire para baixo a 1.500 x g por 2 min a 4 ° C.
- Repita para um total de 3 lavagens. Ressuspenda os grânulos em PLB até um volume final de n × 40 μl.
- Adicione 40 μl de pasta de esferas de STREP a 50% a cada amostra de lisado celular e nutato por 2 horas a 4 ° C.
- AP estreptocócico
- Centrifugar a solução a 1.500 x g durante 2 min a 4 °C.
- Remova o sobrenadante e armazene-o como "STREP AP Flow-through (FT)" a 4 °C.
- Adicione 500 μl de STREP AP Wash Buffer I (20 mM Tris-HCl pH 7,5, 250 mM NaCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 5% de glicerol e 0,2% de NP-40) aos grânulos. Nutate a mistura de grânulos por 5 min a 4 ° C e centrifugue a 1.500 x g por 2 min a 4 ° C. Descarte o sobrenadante.
- Repita para um total de 4 lavagens.
nota: Antes da quarta lavagem, transfira a solução de grânulos para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para reduzir o fundo proteico. Esta etapa é essencial.
- Adicione 500 μl de tampão de lavagem II (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM de NaCl e 1 mM de EDTA) e equilibre os grânulos invertendo os tubos. Gire para baixo a 1.500 x g por 2 min a 4 ° C e descarte o sobrenadante.
- Eluir a proteína de interesse com 50 μl de tampão de eluição STREP (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA e 2,5 mM de destiobiotina). Vórtice a 800 rpm por 15 min a 4 °C.
- Gire os grânulos a 1.500 x g por 1 min a 4 ° C. Colete o sobrenadante. Esta fração corresponde à amostra "Estreptococos AP Elution".
- Conservar a fracção de esferas a 4 °C para uma segunda eluição, que pode produzir até metade da quantidade de proteína obtida com a primeira eluição. Alíquota de 10% da eluição STREP AP para coloração de prata e/ou western blotting.
- Equilibrando as contas FLAG
- Retirar (n x 16 μl) + n μl da solução de esferas FLAG (n = número de amostras) e centrifugar a 1.500 x g durante 2 min a 4 °C.
nota: Use pontas de boca larga para pipetar contas.
- Remova o sobrenadante e adicione 500 μL de tampão de lavagem FLAG (100 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA e 0,1% NP-40) aos grânulos. Gire para baixo a 1.500 x g por 2 min a 4 ° C. Repita para um total de 3 lavagens.
- Ressuspenda os grânulos no tampão de lavagem FLAG até um volume final de n x 16 μl.
- Adicionar 16 μl de pasta de esferas FLAG à eluição STREP AP restante e à nutato durante a noite a 4 °C.
5. IP SINALIZADOR
- Gire a suspensão dos grânulos FLAG a 1.500 x g por 2 min a 4 °C. Guarde o sobrenadante e guarde-o como o "FLAG IP Flow-through" (FT) a 4 °C.
- Adicione 500 μl de tampão de lavagem FLAG à solução. Nutate por 5 min a 4 °C e centrifugue a 1.500 x g por 2 min a 4 °C. Repita por um total de 4 lavagens e remova o sobrenadante após cada lavagem.
nota: Antes da quarta lavagem, transfira a solução de esferas de proteína para um novo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para reduzir o fundo. Esta etapa é essencial.
- Remova o sobrenadante do centrifugação final e adicione 30 μL de tampão de lavagem FLAG contendo 200 ng/μl de peptídeo FLAG nos grânulos. Vórtice a 800 rpm por 2 horas a 4 °C.
- Gire a suspensão a 1.500 x g por 2 min a 4 °C. Colha o sobrenadante e armazene a 4 °C como a "eluição FLAG IP".
nota: As amostras de eluição podem ser confirmadas por coloração de prata e/ou western blot usando protocolos padrão e estão prontas para outros ensaios de proteína. Ao configurar um western blot, execute todos os seguintes exemplos: (1) Entrada STREP AP, (2) STREP AP FT, (3) Estrep AP Elution, (4) FLAG IP FT e (5) FLAG IP Elution. Os volumes carregados terão que ser determinados para cada experimento. Todas as amostras e grânulos coletados podem ser armazenados a 4 °C para armazenamento de curto prazo e a -80 °C para armazenamento de longo prazo. As amostras de TAP podem ser analisadas por espectrometria de massa para verificar a identidade de seus componentes, identificar novas modificações pós-traducionais (PTMs) e/ou descobrir qualquer nova interação proteica com o complexo purificado. Para isso, depois de passar um gel coomassie ou uma mancha de prata, as bandas podem ser excisadas do gel usando um bisturi limpo. Várias revisões excelentes que discutem métodos de espectrometria de massa foram publicadas anteriormente.