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Para o presente estudo, uma proteína de fusão CVN-small ubiquitin-like modifier (SUMO) foi usada em ensaios imunoenzimáticos em vez de CV-N e é adequada para ensaios baseados em células. A proteína HA H3 do vírus influenza A recombinante de comprimento total é obtida comercialmente (ver Tabela de Materiais) ou expressa em linhagens celulares HEK293 de mamíferos e células de insetos infectadas por baculovírus de acordo com protocolos padrão. A proteína spike Wuhan-1 é expressa em células HEK293 de mamíferos. A síntese de peptídeo mon-manossilado (MM) e peptídeo di-manosilado (DM) permite a detecção de ligantes homogêneos para CVN2 e pequenas moléculas mono-manosiladas.
1. Criando construções CV-N
- Para cada uma das variantes CVN2 e proteína CVN2L0 (PDB ID 3S3Y), obtenha a construção do gene com uma sequência líder pelB N-terminal e His-tag no vetor pET27b (+) de fontes comerciais (ver Tabela 1).
- Obtenha CVN2L0 e suas variantes (V2, V3, V4 e V5; Figura 1A, C) no fundo de um gene modelo CVN2L0 que consiste em duas sequências de DNA distintas para cada repetição CV-N.
- Dissolver o ADN do plasmídeo liofilizado em água destilada desionizada estéril (ddH2O) até uma concentração final de 100 ng/μl.
2. Preparação de placas de ágar LB com células transformadas de DNA plasmidial
- Prepare o meio de cultura LB-Lennox dissolvendo 10 g/L de peptona, 5 g/L de extrato de levedura e 5 g/L de NaCl em ddH2O (consulte a Tabela de Materiais) e ajuste o pH para 7,4. Realizar a transformação em E. coli BL21 (DE3) competente para cada variante (V2-V5) por método químico, seguindo um relatório previamente publicado.
- Divida a solução (900 μL e 100 μL), transfira 100 μL em placas de ágar LB (50 μg / mL de canamicina) e use suavemente um espalhador de células estéril. Incubar as placas de ágar-ágar durante a noite a 37 °C.
3. Clonagem
- Subclonar o gene para CV-N nos sítios NdeI e BamHI de pET11a (ver Tabela de Materiais) para transformação (eletroporação) em células eletrocompetentes após referência.
4. Mutagênese dirigida ao local
- Gerar CVN2L0 e CVN-E41A mutante no fundo de um gene modelo CVN2L0 contendo duas sequências de DNA distintas para cada repetição CV-N.
- Faça mutações usando um kit de mutagênese dirigida ao local (consulte a Tabela de Materiais) e primers mutagênicos específicos 5'-gagaaccgtcaacgtttgcgataacagagttcagg-3' e 5'-cctgaactctgttatcgcaaacgttgacggttctc-3' para executar o PCR.
- Inicie uma série de reações de amostra usando várias concentrações de molde de DNA de fita dupla (dsDNA) variando de 5-50 ng (por exemplo, 5, 10, 20 e 50 ng de molde de dsDNA). Mantenha a concentração do primer constante.
nota: A mistura de PCR e o protocolo de ciclagem térmica são geralmente usados conforme descrito no manual de instruções para o kit de mutagênese dirigida ao local.
- Adicione a enzima de restrição DpnI (1 μL, 10 U/μL, consulte a Tabela de Materiais) abaixo da cobertura de óleo mineral. Misture bem e suavemente as reações, gire em uma microcentrífuga de mesa por 1 min e incube imediatamente a 37 ° C por 1 h para digerir o dsDNA superenrolado parental.
5. Transformação de células bacterianas
- Descongele as células supercompetentes XL1-Blue (consulte a Tabela de Materiais) suavemente no gelo. Para transformar cada reação de controle e amostra, alíquota das células supercompetentes (50 μL) em um tubo de polipropileno de fundo redondo pré-resfriado (14 mL).
- Transferir 1 μL do ADN de cadeia simples (ssDNA) tratado com Dpn I de cada reacção de controlo e de amostra (ssDNA mutado) para alíquotas separadas das células supercompetentes, que sintetizam a fita complementar. Agite as reações de transformação cuidadosamente para misturar e incubar as reações no gelo por 30 min.
nota: Antes de transferir o DNA tratado com Dpn I para a reação de transformação, recomenda-se remover cuidadosamente qualquer óleo mineral restante da ponta da pipeta. Como controlo opcional, a eficiência de transformação das células supercompetentes XL1-Blue deve ser verificada misturando 0,1 ng/μl do plasmídeo de controlo pUC18 (1 μL) com uma alíquota de 50 μL das células supercompetentes.
- Aplique pulso de calor nas reações de transformação a 42 ° C por 45 s e, em seguida, coloque as reações no gelo por 2 min.
nota: O pulso de calor aplicado já foi otimizado para as condições mencionadas em tubos de polipropileno de fundo redondo (14 mL).
- Adicione 0,5 mL de caldo NZY+ (contendo por litro: 10 g de amina NZ (hidrolisado de caseína), 5 g de extrato de levedura, 5 g de NaCl, 12,5 mL de 1 M MgCl2, 12,5 mL de 1 M MgSO4, 10 mL de glicose 2 M, pH 7,5 e pré-aquecido a 42 °C) e incube as reações de transformação a 37 °C com agitação a 225-250 rpm por 1 h. Coloque o volume correto de cada reação de transformação (5 μL da transformação do plasmídeo de controle; 250 μL da transformação da amostra) em placas de ágar LB-ampicilina.
nota: Para os controles de transformação e mutagênese, espalhe as células em placas de ágar LB-ampicilina contendo 5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosídeo (X-gal, 80 μg / mL) e isopropil-1-tio-β-D-galactopiranosídeo (IPTG, 20 mM) (ver Tabela de Materiais). Inocular 50 ml das culturas de células com uma única colónia de células de E. coli transformadas para purificar o ADN plasmídico mutado para análises. A mutagênese é confirmada por sequenciamento de DNA em uma instalação externa.
6. Expressão e purificação de proteínas
- Para uma cultura em larga escala, inocule uma pequena quantidade de LB (contendo ampicilina) com uma única colônia da placa transformada.
- Usando a cultura noturna, inocule a cultura de expressão com aditivos, como 10 mM de MgCl2, 10 mM de MgSO4 e 20 mM de glicose, diluindo a cultura de sementes para 1/100.
- Cultive células com agitação vigorosa a 37 ° C. Cultive células a um Abs 600 nm entre 0,4-0,6 (fase intermediária) antes de resfriar as células a 20 ° C. Induza com 1 mM IPTG e cresça durante a noite.
- Em seguida, colher as células centrifugando a 4.000 x g durante 15 min a 4 °C e rejeitar o sobrenadante com uma pipeta.
- Ressuspenda o pellet celular em tampão salino tampão tampão com fosfato (PBS) e centrifugue novamente a 4.000 x g por 15 min a 4 ° C. Em seguida, descarte o sobrenadante com uma pipeta. Ressuspender o sedimento restante em 10 ml de tampão de lise e incubar a suspensão durante 1 h a 37 °C.
nota: Composição do tampão de lise: (50 mM de NaH2PO4, 300 mM de NaCl, 2% Triton-X 100, 500 ng/mL de lisozima, 1 mM de fluoreto de fenilmetilsulfonil (PMSF), 1 mM de ditiotreitol, 1 mM de MgCl2, pH 8, ver Tabela de Materiais).
- Submeter a mistura a dois ciclos de congelação e descongelação (-80 °C). Separe as frações solúveis e insolúveis por centrifugação a 4.000 x g por 15 min a 4 °C e analise-as usando eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE), em particular, dodecil sulfato de sódio (SDS)-PAGE (Figura 1B, C).
nota: As células podem ser lisadas de várias maneiras, como congelamento-descongelamento, sonicação, homogeneização, lise enzimática ou uma combinação desses métodos. A purificação de corpos de inclusão é recomendada para coletar altos rendimentos de proteína.
- Purificar as proteínas utilizando cromatografia em coluna Ni-NTA (ver Tabela de Materiais). Carregar a fracção solúvel numa coluna de esferas de Ni-NTA regenerada (1 ml/min). Lave o sistema com tampão TBS (50 mM de Tris, 150 mM de cloreto de sódio, pH 7,5) antes de iniciar um gradiente (0-100% 500 mM de imidazol em TBS durante 60 min) e coletar frações (1 mL / min). Dialisar as proteínas purificadas para caracterização bioquímica contra PBS 100 mM (Figura 1C, D).
- Alternativamente, use o gel de afinidade His-SelectNi 2+ (consulte a Tabela de Materiais) em tubos de 14 mL para ligar e ressuspender o CV-N expresso recombinantemente marcado marcado com his em soluções tampão com 20 mM de imidazol e 250 mM de imidazol, respectivamente. Incubar em batelada por pelo menos 30 min.
nota: Aplique essas proteínas semipurificadas a uma coluna pré-embalada de uso único para troca de tampão e limpeza de amostras biológicas, por exemplo, carboidratos e proteínas, que podem carregar 1-1,5 mL de eluído de cromatografia de afinidade de metal imobilizado.
- Transferir as soluções proteicas para tubos de centrifugação com um filtro de corte de 10 kDa (ver Tabela de Materiais) e concentrar-lhes centrifugando durante 10 min a 4.500 x g e 4 °C. Para medições de SPR, troque as soluções analitas por HEPES 10 mM, cloreto de sódio 150 mM, ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) 3 mM e Tween20 0,05%, pH 7,4 (HBS-EP (+), consulte a Tabela de Materiais).
- Adicionar este tampão de funcionamento SPR a um factor de diluição de 1:10 e centrifugar quatro vezes até ao volume inicial durante 10 minutos a 4.500 x g e 4 °C.
- Determinar a concentração de proteínas a 280 nm utilizando um espectrofotómetro NanoDrop UV-Vis (ver quadro de materiais) com base no coeficiente de extinção calculado (20,440 M-1 cm-1) para a proteína principal CVN2L0 com um tamanho de 23,474 Da. Utilizar PBS (100 mM, pH 7,0) ou tampão SPR como branco e medir a concentração de proteínas em três fases de diluição (1:1, 1:10 e 1:100).
7. Espectroscopia SPR
- Use o sistema SPR de canal duplo (consulte a Tabela de Materiais) com tampão de execução HBS-EP (+) e 10 mM de glicina HCl pH 1,5-1,6 como tampão de regeneração. Ligue o instrumento, o desgaseificador, o amostrador automático e a bomba e lave todo o sistema com ddH20 por 1 h. Coloque o buffer de corrida pronto para uso em uma garrafa separada.
- Coloque o óleo de imersão no detector e monte um chip sensor de vidro (consulte a Tabela de Materiais) revestido com uma fina película de ouro e na parte superior funcionalizado com hidrogel de carboximetil dextrano diretamente no detector abaixo da célula de fluxo de três portas. Corrija a configuração puxando para baixo o handling.
nota: C19RBDHC30M hidrogel carboximetil dextrano derivatizado de estreptavidina de 200 nm com densidade média de proteína RBD coronavírus-2 biotinilada da síndrome respiratória aguda grave, é um chip sensor pronto para uso com o ligante pré-imobilizado.
8. Ensaio de ligação de SPR para ligação de CV-N a HA, proteína S e RBD
- Imobilize os ligantes proteicos nos chips sensores seguindo as etapas abaixo.
- Abra uma tabela de execução clicando em Formulário na barra de menus e Editor de tabela de execução no software SPRAutoLink integrado (consulte Tabela de materiais). Escolha e clique em BASIC_Immobilization na lista de tabelas de execução disponíveis e siga as etapas do procedimento experimental na tela do computador. O respectivo Editor de Amostra usado é mostrado no canto superior direito.
- Clique em Editor de conjunto de amostras na seção Formulário para preencher a lista de reagentes de dois racks colocados no amostrador automático para análises posteriores. Clique em Autosampler Direct Control como uma "Ferramenta" na barra de menus para trazer os racks para frente ou para casa. Escolha 4 °C como a temperatura de operação.
nota: O software SPR permite "Controle Direto do Instrumento SPR" e "Controle Direto da Bomba" selecionando as ferramentas correspondentes, bem como o manuseio do amostrador automático e clicando em Formulário; também Executar Editor de Tabela, Plotagem de Dados ou Pós-Processamento podem ser escolhidos para realizar a análise de dados. Os arquivos são salvos diretamente no diretório padrão e exportados como scrubber.files na janela Pós-processamento.
- Inicie a bomba para infundir ddH20 clicando em Ferramentas e Controle Direto da Bomba e registre os dados clicando em Controle Direto do Instrumento SPR e, a cada vez, inicie nas janelas que aparecem recentemente. Coloque os reagentes de acoplamento (etapa 8.3) em frascos de 300 μL, coloque-os nos racks do amostrador automático e inicie a tabela de execução clicando em Executar.
nota: As superfícies dos cavacos são condicionadas com tampão glicina 10 mM pH 9,0 ou podem ter sido lavadas com cloreto de sódio 1 M, tampão borato de sódio 0,1 M pH 9,0 para condicionar a superfície do cavaco derivatizado de carboxila para mistura de ativação EDC/NHS.
- Para esta interação proteína-proteína simples, use o chip CMD500D (consulte a Tabela de Materiais) para gerar uma unidade de índice de microrrefração (μRIU) = célula de fluxo 2500 - 3000 com HA imobilizado e μRIU = célula de fluxo 400 com proteína spike. A uma taxa de fluxo de infusão de 15 μL / min, injete uma mistura aquosa e igual de cloridrato de 0,4 M N-etil-N'-(dimetilamino propil) carbodiimida (EDC * HCl) e 0,1 M N-hidroxisuccinimida (NHS) aplicando as seguintes etapas sequenciais.
- Reabasteça o reabastecimento da bomba a 25.000 μL/min, execute o ajuste da linha de base por 30 s, injete 90 μL de solução de ativação da amostra (EDC/NHS) durante 6 minutos de tempo de contato e, em seguida, segure por mais 5 minutos.
- Repita este ciclo após a linha de base por 1 min a 10 μL / min apenas na célula de fluxo esquerda (azul) para injetar e imobilizar peptídeos sintetizados quimicamente, HA e proteína spike a 20 μg / mL e permita o ajuste basal subsequente com ddH2O por 1,5 min antes de extinguir a superfície do chip ativado com 1 M etanolamina HCl pH 8,5.
- Mudar os tubos do amostrador de líquido para o desgaseificador de ddH20 para o frasco com HBS-EP(+) (figura 2).
- Analise os sensorgramas SPR.
- Para realizar estudos cinéticos, use várias concentrações de analitos (10-5-10-8 M), com uma etapa de regeneração após cada injeção e medições em branco após diferentes analitos. Altere a taxa de fluxo para 10 μL / min e inicie as injeções por 4 minutos de tempo de contato, depois 5 minutos de geração de linha de base e duas etapas de regeneração de 2 minutos cada com um intervalo de 30 s.
- Injete a solução tampão para medições em branco cujos sensorgramas são subtraídos das execuções de amostras para normalizar diferentes concentrações de proteínas.
- Clique em Formulário, role para baixo e mude para "Pós-processamento" clicando neste modo de operação. Clique em Adicionar para selecionar as curvas de vinculação geradas ao longo do tempo no Formulário de plotagem de dados para cada célula de fluxo e exporte a sobreposição como um arquivo de depuração (.ovr). Clique em Arquivo para abrir as opções de salvamento de arquivos. Obtenha curvas de resposta alinhando as curvas esquerda e direita e subtraindo os sinais do segundo canal de referência daqueles do canal do ligante.
nota: Os dados são operados em "Pós-Processamento" definindo sensorgramas computacionalmente. Ele é colocado em uma sobreposição de sensorgramas de células de fluxo esquerda e direita, ou representado como sensorgramas a partir da diferença de ambos os canais.
- Limpe todos os fluidos com tampão glicina 50-100 mM pH 9,5, água e etanol 20% antes e depois das medições de ligação para remover vestígios de sal ou qualquer contaminação proteica, ou mais rigoroso, com 0,5% SDS e glicina.
nota: Para evitar danos ao instrumento, recomenda-se verificar a estabilidade mecânica do chip de vidro antes de reinserir o cartucho do chip no instrumento se os chips tiverem sido armazenados sob um buffer ou com 100% de umidade.
Tabela 1: Dados cinéticos obtidos de sensorgramas SPR para a ligação das variantes de ligação CVN2L0 e Cys-Cys V2, V4 e V5 ao HA usando um modelo de ligação Langmuir 1:1. KD [M] = kdesligado/kligado ou kd/ka. Todos os dados são gerados a 25 °C em buffer HBS-EP(+).
| Analito | kem [M-1*s-1] | koff [s-1] | KD |
| CVN2L0 | 5.1 Ep3 | 1.3 E-3 | 255 nM |
| V2 | 4.0 E3 | 1.1 E-3 | 275 nM |
| V4 | 1.2 E3 | 1.3 E-3 | 11 μM |
| V5 | 1.2 E3 | 5.8 e-2 | 5 μM |
