Ressonância Magnética Nuclear para Estudo de Interações Proteína-Proteína em Nível Atômico

Resumo

Fonte: Winkelaar, G., et al. Medindo Interações de Proteínas Globulares e Filamentosas por Espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN) e Termoforese em Microescala (MST). J. Vis. Exp. (2018).

Este vídeo descreve a técnica de espectroscopia de ressonância magnética nuclear para estudar as interações proteína-proteína entre ¹⁵proteínas envoplakin mutantes e do tipo selvagem marcadas com N e a proteína vimentina não marcada. A interação bem-sucedida entre a envoplaquina do tipo selvagem e a vimentina leva a um extenso alargamento da linha e ao desaparecimento do pico nos espectros de RMN, enquanto a ausência de uma interação entre a envoplaquina mutada e a vimentina resulta em picos bem resolvidos nos espectros de RMN.

Protocolo

1. Métodos de RMN

1. Preparação de amostras de RMN
   1. Purifique ¹⁵proteínas de tipo selvagem ou R1914E E-PRD marcadas com N usando 20 mM de Tris-HCl, 1 mM de DTT, pH 7. As soluções de estoque de proteínas geralmente variam de 0,3 a 1 mM com volumes de cerca de 1 mL.
      nota: A proteína pode ser concentrada a >100 μM usando um dispositivo de ultrafiltração centrífuga MWCO de 3 kDa, 5 mL para trazer a concentração para uma faixa adequada para a preparação da amostra.
   2. Purifique uma amostra de proteína VimRod não marcada usando 20 mM de Tris-HCl, 1 mM de DTT, pH 7.
   3. Num volume final de 500 μl, adicionar a proteína E-PRD selvagem ou mutante a uma concentração final de 100 μM, o óxido de deutério (D₂O) a uma concentração final de 10% (v/v) e o DSS (ácido 4,4-dimetil-4-silapentano-1-sulfónico) a uma concentração final de 20 μM. Aumentar o volume da amostra até 500 μL utilizando 20 mM de Tris-HCl, 1 mM DTT e pH 7. O preparo da amostra representativa está descrito na Tabela 1.
      nota: A ressonância de 0 ppm do DSS é usada para calibrar os deslocamentos químicos de ¹H, bem como para referência indireta dos deslocamentos químicos de ¹⁵N da proteína. D₂O é usado para o sinal de bloqueio de deutério para manter o espectrômetro operando em um campo magnético líquido constante.
   4. Faça uma segunda amostra de E-PRD, D₂O e DSS como na etapa anterior e adicione VimRod a uma concentração final de 50 μM antes de aumentar o volume para 500 μL.
   5. Transferir as amostras de 500 μL para tubos de RMN de 5 mm de largura para a experiência.

2. Configuração experimental de RMN

1. Ligue o fluxo de ar com o comando de ejeção "ej"; isso trará a amostra do ímã. Agora, coloque a amostra dentro de um spinner em cima do ímã pela abertura e insira-a com o comando "ij". Aguarde até que a amostra se acomode dentro do ímã antes de prosseguir.
2. Crie um novo conjunto de dados usando o comando "edc" e carregue os parâmetros padrão de ^{RMN de 1}H selecionando o experimento "ZGPR" (Figura 1). Preencha os campos NAME, EXPNO (número do experimento) e PROCNO (número da pasta de dados processados). Selecione o solvente no campo "Definir solvente" e clique em "Executar 'getprosol'" para ler o cabeçote da sonda padrão e os parâmetros dependentes de solvente (prosol).
3. Trave a amostra no solvente deuterado, ou seja, D₂O, usando o comando "lock" e espere até que termine de varrer e atinja o bloqueio.
4. Corrija a frequência de ressonância do ímã sintonizando a amostra usando o comando de sintonia automática "atma". Monitore a curva de oscilação até que o ajuste automático seja concluído.
5. Calce o campo magnético usando TOPSHIM (comando "topshim"). Shimming é o processo de ajustes em um campo magnético para obter uniformidade ao redor da amostra. É uma boa prática armazenar os valores de shim com o comando "wsh" e lê-los usando "rsh" antes do topshim, se estiver usando amostras iguais ou semelhantes.
6. Ajuste o ganho do receptor com o comando "rga" para obter a máxima relação sinal-ruído.
7. Coloque o centro do espectro no deslocamento de ressonância da água (o1) e defina o pulso de prótons de 90 graus (p1) em alta potência usando "calibo1p1".
8. Colete o espectro de prótons usando o comando zero go "zg" e processe com "efp" que inclui multiplicação exponencial ("em"), o decaimento de indução livre (FID) incorporando alargamento de linha, transformação de Fourier "ft" de FID e "pk" para aplicar correção de fase.
9. Aplique a correção automática de fase "apk" e a correção automática de linha de base "absn" usando a opção polinomial sem integração.
10. Crie um novo conjunto de dados (como em 1.2.2) para o experimento SOFAST HMQC selecionando "SFHMQC3GPPH" no experimento.
11. Copie P1 e O1 otimizados do espectro de prótons e preencha os pulsos dependentes de P1 usando o comando "getprosol 1H p1 plw1", onde p1 é o valor P1 otimizado e plw1 é o nível de potência para P1.
12. Otimize a constante CNST54 para definir o deslocamento químico da amida e CNST55 para definir a largura de banda a fim de abranger as regiões espectrais de interesse, o que permite que o ganho do receptor seja otimizado (Figura 2). Para selecionar esses parâmetros, extraia o primeiro FID (decaimento por indução livre) do espectro bidimensional e procure o sinal observado para defini-los. Além disso, varie o atraso de relaxamento (D1), o número de varreduras (NS) e as varreduras fictícias (DS) para obter uma sensibilidade de sinal aceitável com o comando "gs", que permite que go e scan monitorem a qualidade dos dados em tempo real.
13. Registre os espectros usando Zero Go "zg".

Tabela 1. Preparação de amostras de RMN.

amostra	1 mM E-PRD no tampão A (μL)	1mM VimRod no tampão A1 (μL)	Tampão A (μL)	200 μM DSS em D2O (μL)	Tampão B2 (μL)	Volume total (μL)
E-PRD sozinho	50	0	50	50	350	500
E-PRD + VimRod	50	50	0	50	350	500
1Tampão A: 20 mM Tris-HCl, 1 mM DTT, pH 7
2Tampão B: 23 mM Tris-HCl, 1,14 mM DTT, pH 7

Resultados

Figura 1: Captura de tela da configuração do experimento de RMN. A janela mostrada é usada para configurar um experimento padrão para coletar um conjunto de dados HSQC. Os parâmetros do experimento são lidos ao lado do experimento. O experimento ZGPR mostrado é escolhido como um experimento inicial para carregar os parâmetros de prótons padrão e dependentes de solvente. A janela Título é usada para i...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Cloreto de amônio (15N, 99%)	Laboratórios de Isótopos de Cambridge	NLM-467	Marcação isotópica para RMN
D2O, óxido de deutério (D, 99,8%)	Laboratórios de Isótopos de Cambridge	DLM-2259	Preparação de amostras de RMN
DSS, 2,2-dimetil-2-silapentano-5-sulfonato-D6 de sódio (D,98%)	Laboratórios de Isótopos de Cambridge	DLM-8206	Referência para RMN
Tubos NMR de precisão de 5 mm, 7" de comprimento	SJM/Deuterotubes	BOROECO-5-7	Tubos de RMN
Espectrômetro de RMN (14,1 Tesla)	Bruker		Aquisição de dados de RMN
Sonda criogênica TCI 5mm z-PFG	Bruker		Aquisição de dados de RMN
software
Bruker TopSpin 4.0.1	Bruker		Processamento de dados de RMN