Usando a exibição de fagos para selecionar proteínas com alta afinidade com uma proteína-alvo

Resumo

Fonte: Zhang, W., et al., Usando a exibição de fagos para desenvolver moduladores variantes de ubiquitina para E3 Ligases. J. Vis. (2021)

Neste vídeo, demonstramos a técnica de exibição de fagos para isolar fagos pré-projetados que expressam proteínas com alta afinidade com a proteína-alvo.

Protocolo

1. Prepare a biblioteca de fagos

1. Descongele a biblioteca de fagos no gelo e dilua-a para 100 vezes a diversidade da biblioteca no PBS. Por exemplo, se a diversidade da biblioteca for 1 x 10¹⁰ e a concentração da biblioteca for 1 x 10¹³, dilua a biblioteca para que a concentração seja 1 x 10¹². Para as bibliotecas usadas aqui, dilua-as 10 vezes em PBS, combinando 1 mL da biblioteca com 9 mL de PBS.
   nota: A diversidade da biblioteca deve ter sido determinada durante a criação da biblioteca e não pode ser facilmente avaliada de outra forma. A concentração da biblioteca pode ser determinada inoculando células de E. coli na fase intermediária (OD600 0,6 - 0,8) e plaqueamento em LB/carb.
2. Adicione 1/5 do volume de PEG/NaCl. Por exemplo, para 10 mL da biblioteca previamente diluída, adicione 2 mL de PEG/NaCl.
3. Incubar no gelo por 30 min.
4. Centrifugue a 11.000 x g por 30 min a 4 °C, descarte o sobrenadante e centrifugue novamente por 2 min para puxar para baixo o sobrenadante restante.
   nota: Coloque o tubo no rotor na mesma orientação na segunda vez, pois foi o primeiro para manter o pellet no mesmo lugar, facilitando a visualização.
5. Ressuspenda suavemente o pellet de fago em 1 mL de PBT por proteína. Para quatro proteínas, ressuspender o pellet em 4 mL de PBT.
   nota: Tente não tocar no pellet e não introduza bolhas de ar.

2. Exibir fago para a(s) proteína(s) alvo(s)

1. Controle opcional: Adicione 100 μL de biblioteca de fagos a cada poço revestido na placa de controle. Incubar à temperatura ambiente (~20-25 °C) durante 1 h com agitação orbital de 300 rpm e transferir a biblioteca da placa de controlo para a placa alvo.
2. Remova o tampão PB da placa alvo e adicione 100 μL da biblioteca de fagos a cada poço revestido.
3. Incubar à temperatura ambiente (~20-25 °C) durante 1 h com agitação orbital de 300 rpm.

3. Eluir em volta de um fago

1. Remova a biblioteca de fagos e lave os poços revestidos quatro vezes com tampão PT. Inverta o prato e bata em uma toalha de papel para remover as últimas gotas.
   nota: Se várias proteínas-alvo forem revestidas em uma placa, tente minimizar o fluxo de todas as soluções subsequentes entre os poços.
2. Adicione 100 μL de HCl 0,1 M a cada poço revestido e incube em temperatura ambiente por 5 min com agitação orbital de 300 rpm.
3. Neutralize o pH adicionando 12,5 μL de Tris-HCl 1 M (pH 11) a cada poço revestido.
4. Agrupe o fago eluído de todos os 8 poços em um único tubo de microcentrífuga de 1,5 mL. Pipete para cima e para baixo durante a transferência para tornar as soluções homogêneas e aspirar todo o líquido dos poços.
5. Adicione 10% de BSA ao fago eluído combinado até uma concentração final de 1%. Para um volume típico de eluição de 950 μL, adicione 95 μL de 10% de BSA. Conservar a 4 °C. Esta é a saída da primeira rodada.

4. Preparação para as rondas de selecção subsequentes

1. Prepare uma cultura de sementes para cultivar a entrada de fagos para a próxima rodada de seleção, como na etapa 1.1.
2. Cubra a placa para a terceira rodada de seleção como na etapa 1.2 com as alterações indicadas abaixo.
   1. Cubra apenas quatro poços por proteína em uma placa de ligação de 96 poços. Use metade do conteúdo dos tubos "redondos 2/3" ou "redondos 4/5" para o arredondamento apropriado. Dilua o conteúdo desses tubos conforme necessário, a fim de evitar que as proteínas se depositem na solução.
3. Prepare a entrada do fago para a próxima rodada de seleção.
   1. Use metade da saída da rodada um para inocular 3 mL de células da fase intermediária. Para uma saída típica da primeira rodada, inocule com 500 μL da saída.
   2. Incubar a 37 °C durante 30 min com agitação orbital de 200 rpm.
   3. Adicione o fago auxiliar M13K07 a uma concentração final de 1 x 10¹⁰ PFU/mL.
   4. Incubar a 37 °C durante 1 h com agitação orbital de 200 rpm.
   5. Transfira todos os 3 mL de cultura para 30 mL de 2YT / carburador / kan. Crescer durante a noite a 37 °C com agitação orbital de 200 rpm.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Sistema de Mini Tubo Axygen (0,65 mL, estéril, 96/rack, 10 racks/pacote)	Fisher Científico	14-222-198	Artigos de plástico
Meios de cultura desidratados BD Difco: LB Broth, Miller (Luria-Bertani)	Fisher Científico	DF0446-17-3	Preparando placas para titulação
Albumina de Soro Bovino (BSA), Fração V	BioShop Canadá	ALB001	Componente de buffer
Sal dissódico de carbenicilina 89,0-100,5% anidro	Millipore-Sigma	C1389-5G	Cultura de células infectadas por fagídeos
Agitador de microplacas digital compacto	Fisher Científico	11-676-337	dispositivo
Fita de vedação de alumínio Corning Microplate	Fisher Científico	200/07/684	Selagem de estoques de glicerol de fagos
Ágar desidratado	Fisher Científico	DF0140-01-0	Preparando placas para titulação
Espectrofotômetro/fluorômetro DS-11	DeNovix	DS-11 FX+	dispositivo
Microplaca Greiner Bio-One CellStar de 96 poços, não tratada, fundo em U	Fisher Científico	7000133	Artigos de plástico
ácido clorídrico	Fisher Científico	Resposta A144-500	químico
Invitrogen One Shot OmniMAX 2 T1R E. coli quimicamente competente	Fisher Científico	C854003	Cepa bacteriana para infecção por fagos
Sulfato de canamicina	Fisher Científico	AAJ1792406	Cultura de células infectadas por fagos auxiliares M13K07
M13KO7 Fago Auxiliar	Biolabs da Nova Inglaterra	N0315S	Permitir empacotamento e secreção de fagemídeos
Agitador orbital de bancada MaxQ 4000	Fisher Científico	11-676-076	dispositivo
Microplaca Nunc MaxiSorp de 96 poços, fundo plano	Tecnologias da Vida	Telefone: 44-2404-21	Artigos de plástico
Solução salina tamponada com fosfato (PBS) 10X	Fisher Científico	BP3994	Componente tampão/meio de ressuspensão de fago
Filmes de poliéster para ELISA e incubação	VWR	Nº 60941-120	Cobrindo as microplacas durante a incubação
Polietilenoglicol 8000 (PEG)	Fisher Científico	BP233-1	Precipitação de fagos
cloreto de sódio	Millipore-Sigma	S3014	Precipitação de fagos
Tubos de cultura de plástico estéril: polipropileno translúcido	Fisher Científico	14-956-1D	Cultivando entradas de fagos
Cloridrato de tetraciclina	Fisher Científico	BP912-100	Cultura de células OmniMax de E. coli
Base Tris	Fisher Científico	BP1525	Solução de fago eluída neutralizante
Triptona em pó	Fisher Científico	BP1421-2	Componente do meio de crescimento celular
Pré-adolescente 20	Fisher Científico	BP337500	Componente de buffer
Extrato de levedura	Fisher Científico	BP1422-2	Componente do meio de crescimento celular