Espectroscopia de Flutuação de Fluorescência para Estudar a Homo-Oligomerização de Proteínas

Neste artigo

Resumo

Fonte: Nolan, R., et al. In Vitro sem calibração Quantificação da Homo-oligomerização de Proteínas Usando Instrumentação Comercial e Software de Análise de Brilho Gratuito e de Código Aberto. J. Vis. Exp. (2018)

Este vídeo demonstra a técnica de espectroscopia de flutuação de fluorescência (FFS) para estudar a homo-oligomerização de proteínas. As proteínas marcadas com fluorescência em uma amostra são dimerizadas usando um agente ao estudar a oligomerização de proteínas usando FFS. Usando um microscópio confocal, à medida que as proteínas se movem para dentro e para fora do pequeno volume de observação, a análise das flutuações no brilho das moléculas fluorescentes é realizada para determinar o estado oligomérico das proteínas.

Protocolo

1. FKBP12 F36V -mVenus Purificação

Células pLysS de transformação (DE3) com vetor pET22b contendo FKBP12F36V12 humano monomerizado e tags N-terminal His6 e mVenus (vetor disponível mediante solicitação). Células da placa em ágar LB suplementadas com 50 μg / mL de ampicilina e 34 μg / mL de cloranfenicol.
Transfira as colônias transformadas para 100 mL de cultura inicial de LB e cresça por 16 a 20 horas a 37 ° C com agitação.
Dilua a cultura inicial densa (OD600 >1) 1:100 em meio LB (2 lotes de 500 mL) e cresça por 2 a 3 horas até OD600 = 0,6 - 0,8 (37 ° C, 200 rpm).
Culturas legais no gelo. Induzir com 250 μM IPTG e cresc....

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Resultados

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Figura 1. Aplicação de N&B para detectar transições de monômero de proteína em solução. (a) Caminho óptico simplificado de um microscópio de varredura a laser (LSM) equipado com uma fonte de laser (ajustada em 514 nm no caso de proteínas marcadas com mVenus) direcionada (setas azuis) em direção a uma objetiva de imersão (em nosso caso, um óleo 63X1.4NA) iluminando uma solução de 100 nM de solução.......