1. FKBP12 F36V -mVenus Purificação
- Células pLysS de transformação (DE3) com vetor pET22b contendo FKBP12F36V12 humano monomerizado e tags N-terminal His6 e mVenus (vetor disponível mediante solicitação). Células da placa em ágar LB suplementadas com 50 μg / mL de ampicilina e 34 μg / mL de cloranfenicol.
- Transfira as colônias transformadas para 100 mL de cultura inicial de LB e cresça por 16 a 20 horas a 37 ° C com agitação.
- Dilua a cultura inicial densa (OD600 >1) 1:100 em meio LB (2 lotes de 500 mL) e cresça por 2 a 3 horas até OD600 = 0,6 - 0,8 (37 ° C, 200 rpm).
- Culturas legais no gelo. Induzir com 250 μM IPTG e crescer por 16 a 20 horas a 21 °C, 200 rpm.
- Colha as células por centrifugação a 2.000 x g por 20 minutos.
- Ressuspenda o pellet em 40 mL de tampão IMAC A (fosfato de sódio 20 mM pH 7,5, NaCl 500 mM, imidazol 3 mM, β-mercaptoetanol 1 mM) suplementado com inibidores de protease sem EDTA (1 comprimido por pellet celular).
- Sonicar células (500 Watts, 20 kHz, 40% de amplitude, 9 s ligado, 11 s desligado por 15 min) em gelo e colher material solúvel por centrifugação a 20.000 x g.
- Transfira o lisado solúvel para um frasco cônico e adicione 2 mL de resina (consulte a Tabela de Materiais). Incubar por 1 hora com rotação de 105 rpm
nota: A sepharose de níquel também pode ser usada para esta etapa do IMAC.
- Colha a resina e lave com 250 mL de tampão IMAC A seguido de 500 mL de tampão IMAC B (fosfato de sódio 20 mM pH 7,5, NaCl 500 mM, imidazol 7 mM, β-mercaptoetanol 1 mM).
nota: Aumente para 50 mM de imidazol se estiver usando resina de níquel sepharose.
- Eluir a proteína marcada com His6 usando o tampão IMAC C (fosfato de sódio 20 mM pH 7,5, NaCl 500 mM, imidazol 300 mM, β-mercaptoetanol 1 mM).
- Injete em uma coluna de exclusão de tamanho (consulte a Tabela de Materiais) equilibrada em HEPES de 10 mM pH 7,5, NaCl de 150 mM e DTT de 1 mM. FKBP12F36V tem seu pico de eluição em 87,71 mL na coluna que usamos.
- Avalie a pureza via SDS-PAGE e agrupe e concentre conforme necessário.
2. Preparação de Matriz de Placas Multipoços
- Descongele o FKBP12F36V purificado (ou proteína de interesse marcada) a -80 °C.
- Prepare uma solução de FKBP12F36V purificada a 100 nM (meio, HEPES 10 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, DTT 1 mM). Sonicar e centrifugar (centrifugação rápida de 13.000 rpm) para evitar a formação de agregados.
- Pipeta de 100 a 200 μL em uma câmara de observação de 8 poços com fundo de vidro.
- Adicione o dímero BB às concentrações finais de 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 e 500 nM.
- Como referência, prepare uma solução de 100 nM de mVenus sozinho para avaliar os efeitos potenciais de agregação e precipitação e recuperar um valor de brilho para o monômero com as mesmas configurações de aquisição.
3. Aquisição confocal sem calibração
- Inicie o sistema confocal (Figura 1). Qualquer sistema confocal de microscópio de varredura de luz equipado com detectores digitais ou detectores analógicos bem caracterizados e capaz de manter um tempo de permanência constante para cada pixel adquirido funcionaria.
- Defina o caminho do feixe de excitação:
- Ligue o laser de 514 nm e ajuste-o para 20 - 100 nW de potência na saída da objetiva (para FKBP12F36V-mVênus).
- Selecione a objetiva 63X1.4NA ou uma objetiva de imersão em água de correção de colar projetada para FCS.
- Ligue um detector HyD, APD ou PMT calibrado. Detectores capazes de contagem de fótons são preferíveis, pois neste caso, o cálculo de S, offset e σ02 são desnecessários.
- Selecione a janela de emissão de 520 - 560 nm
- Defina o orifício em 1 unidade Airy para a emissão correspondente ~545 nm.
- Defina o modo de aquisição para 16 x 16 pixels
- Defina o tempo de permanência do pixel tde modo que satisfaça oquadro t >> TD >> tde permanência, onde TD é o tempo de residência da proteína difusora e oquadro t é a taxa de quadros. Isso correspondeu a definir o tempo de permanência para ~13 μs.
nota: Alguns fabricantes comerciais tinham scanners que não mantinham o tempo de permanência por pixel constante. Essa constância é crucial para que o método funcione.
- Defina o tamanho do pixel em ~120 nm.
- Selecione o modo de aquisição xyt e selecione o número de quadros a serem adquiridos por aquisição e poço (por exemplo, 5.000).
- Se o sistema estiver equipado com um modo de alto rendimento, introduza as coordenadas de cada poço e o número de aquisições por poço para automatizar o processo.
nota: Tenha cuidado para garantir a presença de um dispensador de água se estiver usando uma objetiva de imersão.
- Se o sistema estiver equipado com um sistema de perfusão, carregue a solução BB e programe a perfusão para começar logo após o 5000º quadro para avaliar a cinética de dimerização enquanto adquire, por exemplo, 10.000 imagens.
- Adicione uma gota de óleo na objetiva de imersão em óleo/água se estiver utilizando uma objetiva de imersão em água de correção de colar projetada para FCS.
- Monte a câmara de observação de 8 poços no palco.
- Selecione o poço correto e concentre-se na solução.
nota: IMPORTANTE: Evite focar perto do vidro inferior para evitar reflexos e dispersão. Ao focar mais profundamente na solução, desconecte a opção de foco automatizado.
- Inicie a aquisição e salve a pilha de imagens resultante no formato TIFF.
4. Análise de Tendência e Brilho usando o Pacote R nandb
- Como uma verificação de qualidade de pré-processamento, use o ImageJ para dar uma olhada nas imagens e recuperar o perfil de intensidade, conforme mostrado na Figura 2a. Isso é útil para determinar se ocorreu ou não muito fotobranqueamento. Se houver muito clareamento, os dados não são adequados para análise posterior.
nota: O ImageJ também pode ser útil para converter imagens para TIFF de formatos comerciais. O software nandb descrito abaixo só pode funcionar com arquivos TIFF.
- Baixe e instale o R e o RStudio. É melhor baixar e instalar o R primeiro, depois RStudio.
nota: O que se segue é uma descrição de como usar o pacote R nandb. O conhecimento da linguagem R não é necessário para usar o nandb, no entanto, facilitará a vida.
- Instale o pacote nandb.
- Abra o RStudio e, no console, digite install.packages("nandb") e aguarde a instalação.
- Conheça a nandb
- Review o manual.
- Revise a ajuda interna do RStudio para várias funções. A função mais provável a ser usada será using será brightness(). Exiba o arquivo de ajuda para esta função digitando ? brightness() no console.
- Calcular brilho
- Digamos que alguém tenha um arquivo de imagem na área de trabalho chamado img001.tif (observe que 'nandb' só funciona com arquivos TIFF). Pode-se calcular o brilho dessa imagem:
b <- brilho("~/Desktop/img001.tif", tau = "auto")
- Isso atribui o brilho da imagem à variável b em R. O tau = "auto" garante que a imagem seja corretamente removida antes do cálculo do brilho. A coisa mais comum a fazer a partir daqui é calcular o brilho médio ou mediano da imagem. Pode-se fazer isso digitando mean(b) ou mediana(b). Pode-se também escrever a imagem de brilho na área de trabalho usando
ijtiff::write_tif(b, "~/Desktop/whatever_img_name")
- Digamos que alguém tenha uma pasta cheia de imagens images_folder na área de trabalho e precise calcular os brilhos dessas imagens e escrever as imagens de brilho como arquivos TIFF. Em seguida, veja ?brightness_folder(). Esta função processa uma pasta inteira de uma só vez:
brightness_folder("~/Desktop/images_folder", tau = "auto")
Isso é particularmente bom para aqueles que têm software que preferem ao R porque todos os arquivos são processados em um único comando e, em seguida, pode-se continuar trabalhando com as imagens TIFF de brilho de saída no software escolhido, seja ImageJ, Python ou qualquer outra coisa.
