Espectroscopia de Flutuação de Fluorescência para Estudar a Homo-Oligomerização de Proteínas

1. FKBP12 F36V -mVenus Purificação

1. Células pLysS de transformação (DE3) com vetor pET22b contendo FKBP12F36V12 humano monomerizado e tags N-terminal His6 e mVenus (vetor disponível mediante solicitação). Células da placa em ágar LB suplementadas com 50 μg / mL de ampicilina e 34 μg / mL de cloranfenicol.
2. Transfira as colônias transformadas para 100 mL de cultura inicial de LB e cresça por 16 a 20 horas a 37 ° C com agitação.
3. Dilua a cultura inicial densa (OD600 >1) 1:100 em meio LB (2 lotes de 500 mL) e cresça por 2 a 3 horas até OD600 = 0,6 - 0,8 (37 ° C, 200 rpm).
4. Culturas legais no gelo. Induzir com 250 μM IPTG e crescer por 16 a 20 horas a 21 °C, 200 rpm.
5. Colha as células por centrifugação a 2.000 x g por 20 minutos.
6. Ressuspenda o pellet em 40 mL de tampão IMAC A (fosfato de sódio 20 mM pH 7,5, NaCl 500 mM, imidazol 3 mM, β-mercaptoetanol 1 mM) suplementado com inibidores de protease sem EDTA (1 comprimido por pellet celular).
7. Sonicar células (500 Watts, 20 kHz, 40% de amplitude, 9 s ligado, 11 s desligado por 15 min) em gelo e colher material solúvel por centrifugação a 20.000 x g.
8. Transfira o lisado solúvel para um frasco cônico e adicione 2 mL de resina (consulte a Tabela de Materiais). Incubar por 1 hora com rotação de 105 rpm
   nota: A sepharose de níquel também pode ser usada para esta etapa do IMAC.
9. Colha a resina e lave com 250 mL de tampão IMAC A seguido de 500 mL de tampão IMAC B (fosfato de sódio 20 mM pH 7,5, NaCl 500 mM, imidazol 7 mM, β-mercaptoetanol 1 mM).
   nota: Aumente para 50 mM de imidazol se estiver usando resina de níquel sepharose.
10. Eluir a proteína marcada com His6 usando o tampão IMAC C (fosfato de sódio 20 mM pH 7,5, NaCl 500 mM, imidazol 300 mM, β-mercaptoetanol 1 mM).
11. Injete em uma coluna de exclusão de tamanho (consulte a Tabela de Materiais) equilibrada em HEPES de 10 mM pH 7,5, NaCl de 150 mM e DTT de 1 mM. FKBP12F36V tem seu pico de eluição em 87,71 mL na coluna que usamos.
12. Avalie a pureza via SDS-PAGE e agrupe e concentre conforme necessário.

2. Preparação de Matriz de Placas Multipoços

1. Descongele o FKBP12F36V purificado (ou proteína de interesse marcada) a -80 °C.
2. Prepare uma solução de FKBP12F36V purificada a 100 nM (meio, HEPES 10 mM pH 7,5, NaCl 150 mM, DTT 1 mM). Sonicar e centrifugar (centrifugação rápida de 13.000 rpm) para evitar a formação de agregados.
3. Pipeta de 100 a 200 μL em uma câmara de observação de 8 poços com fundo de vidro.
4. Adicione o dímero BB às concentrações finais de 10, 20, 40, 80, 100, 150, 300 e 500 nM.
5. Como referência, prepare uma solução de 100 nM de mVenus sozinho para avaliar os efeitos potenciais de agregação e precipitação e recuperar um valor de brilho para o monômero com as mesmas configurações de aquisição.

3. Aquisição confocal sem calibração

1. Inicie o sistema confocal (Figura 1). Qualquer sistema confocal de microscópio de varredura de luz equipado com detectores digitais ou detectores analógicos bem caracterizados e capaz de manter um tempo de permanência constante para cada pixel adquirido funcionaria.
2. Defina o caminho do feixe de excitação:
   1. Ligue o laser de 514 nm e ajuste-o para 20 - 100 nW de potência na saída da objetiva (para FKBP12F36V-mVênus).
   2. Selecione a objetiva 63X1.4NA ou uma objetiva de imersão em água de correção de colar projetada para FCS.
   3. Ligue um detector HyD, APD ou PMT calibrado. Detectores capazes de contagem de fótons são preferíveis, pois neste caso, o cálculo de S, offset e σ₀² são desnecessários.
   4. Selecione a janela de emissão de 520 - 560 nm
   5. Defina o orifício em 1 unidade Airy para a emissão correspondente ~545 nm.
   6. Defina o modo de aquisição para 16 x 16 pixels
   7. Defina o tempo de permanência do pixel t_{de modo} que satisfaça o_quadro t >> T_D >> t_{de permanência}, onde T_D é o tempo de residência da proteína difusora e o_quadro t é a taxa de quadros. Isso correspondeu a definir o tempo de permanência para ~13 μs.
      nota: Alguns fabricantes comerciais tinham scanners que não mantinham o tempo de permanência por pixel constante. Essa constância é crucial para que o método funcione.
   8. Defina o tamanho do pixel em ~120 nm.
   9. Selecione o modo de aquisição xyt e selecione o número de quadros a serem adquiridos por aquisição e poço (por exemplo, 5.000).
   10. Se o sistema estiver equipado com um modo de alto rendimento, introduza as coordenadas de cada poço e o número de aquisições por poço para automatizar o processo.
       nota: Tenha cuidado para garantir a presença de um dispensador de água se estiver usando uma objetiva de imersão.
   11. Se o sistema estiver equipado com um sistema de perfusão, carregue a solução BB e programe a perfusão para começar logo após o 5000º quadro para avaliar a cinética de dimerização enquanto adquire, por exemplo, 10.000 imagens.
3. Adicione uma gota de óleo na objetiva de imersão em óleo/água se estiver utilizando uma objetiva de imersão em água de correção de colar projetada para FCS.
4. Monte a câmara de observação de 8 poços no palco.
5. Selecione o poço correto e concentre-se na solução.
   nota: IMPORTANTE: Evite focar perto do vidro inferior para evitar reflexos e dispersão. Ao focar mais profundamente na solução, desconecte a opção de foco automatizado.
6. Inicie a aquisição e salve a pilha de imagens resultante no formato TIFF.

4. Análise de Tendência e Brilho usando o Pacote R nandb

1. Como uma verificação de qualidade de pré-processamento, use o ImageJ para dar uma olhada nas imagens e recuperar o perfil de intensidade, conforme mostrado na Figura 2a. Isso é útil para determinar se ocorreu ou não muito fotobranqueamento. Se houver muito clareamento, os dados não são adequados para análise posterior.
   nota: O ImageJ também pode ser útil para converter imagens para TIFF de formatos comerciais. O software nandb descrito abaixo só pode funcionar com arquivos TIFF.
2. Baixe e instale o R e o RStudio. É melhor baixar e instalar o R primeiro, depois RStudio.
   nota: O que se segue é uma descrição de como usar o pacote R nandb. O conhecimento da linguagem R não é necessário para usar o nandb, no entanto, facilitará a vida.
3. Instale o pacote nandb.
   1. Abra o RStudio e, no console, digite install.packages("nandb") e aguarde a instalação.
4. Conheça a nandb
   1. Review o manual.
   2. Revise a ajuda interna do RStudio para várias funções. A função mais provável a ser usada será using será brightness(). Exiba o arquivo de ajuda para esta função digitando ? brightness() no console.
5. Calcular brilho
   1. Digamos que alguém tenha um arquivo de imagem na área de trabalho chamado img001.tif (observe que 'nandb' só funciona com arquivos TIFF). Pode-se calcular o brilho dessa imagem:
      b <- brilho("~/Desktop/img001.tif", tau = "auto")
      1. Isso atribui o brilho da imagem à variável b em R. O tau = "auto" garante que a imagem seja corretamente removida antes do cálculo do brilho. A coisa mais comum a fazer a partir daqui é calcular o brilho médio ou mediano da imagem. Pode-se fazer isso digitando mean(b) ou mediana(b). Pode-se também escrever a imagem de brilho na área de trabalho usando
         ijtiff::write_tif(b, "~/Desktop/whatever_img_name")
   2. Digamos que alguém tenha uma pasta cheia de imagens images_folder na área de trabalho e precise calcular os brilhos dessas imagens e escrever as imagens de brilho como arquivos TIFF. Em seguida, veja ?brightness_folder(). Esta função processa uma pasta inteira de uma só vez:
      brightness_folder("~/Desktop/images_folder", tau = "auto")
      Isso é particularmente bom para aqueles que têm software que preferem ao R porque todos os arquivos são processados em um único comando e, em seguida, pode-se continuar trabalhando com as imagens TIFF de brilho de saída no software escolhido, seja ImageJ, Python ou qualquer outra coisa.

Figura 1. Aplicação de N&B para detectar transições de monômero de proteína em solução. (a) Caminho óptico simplificado de um microscópio de varredura a laser (LSM) equipado com uma fonte de laser (ajustada em 514 nm no caso de proteínas marcadas com mVenus) direcionada (setas azuis) em direção a uma objetiva de imersão (em nosso caso, um óleo 63X1.4NA) iluminando uma solução de 100 nM de solução de FKBP12F36V-mVenus. A fluorescência de emissão (setas verdes) passa por um espelho dicróico e é direcionada para um filtro passa-banda que limpa a luz de emissão e um orifício definido em 1 unidade Airy situada logo antes de um detector digital pontual capaz de contagem de fótons. (b) Um volume confocal de iluminação é escaneado através de 16 x 16 pixels, iluminando moléculas únicas de FKBP12F36V-mVênus que entram e saem do volume confocal da forma gaussiana, produzindo uma série de flutuações de intensidade de fluorescência. (c) Série de imagens adquiridas ao longo do tempo

Figura 2. A redução automática de tendência é necessária para medir com precisão uma população de monômeros em solução. (a) Uma pilha de 5000 imagens de 16 x 16 pixels foi adquirida conforme descrito na seção Protocolo. A intensidade do primeiro quadro é mostrada junto com o perfil de intensidade médio resolvido no tempo, que mostra flutuações de longo prazo que podem estar relacionadas ao branqueamento e outros efeitos solventes e/ou fotofísicos. Seja qual for a causa dessas flutuações de longo prazo, elas afetam os cálculos de brilho e, portanto, exigem uma redução de tendência. Sem a tendência automática, obtém-se B = 1,026, enquanto após a tendência automática, B = 1,005. Além disso, o brilho sem (painéis esquerdos, segunda linha) e com (painéis direitos, segunda linha) filtragem suave é mostrado. (b) Os mesmos dados apresentados em (a) foram destendenciados e os resultados em termos de intensidade e brilho mostrados.