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1. Clonagem
- Determine as configurações a serem clonadas e escolha um vinculador. Marque as proteínas com os fragmentos no terminal N ou C, conforme descrito abaixo, para que não interrompam sua localização adequada. Use um vinculador flexível, como (GGGGS)x2.
- Marque geneticamente as proteínas de interesse para os fragmentos PAmCherry1. Como opção, use os plasmídeos de clonagem listados na Lista de Materiais contendo os fragmentos RN (resíduos PAmCherry1 1-159) e RC (Met mais resíduos PAmCherry1 160-236) com sequências MCS flanqueadoras.
- Linearizar os plasmídeos que contêm os fragmentos RN e RC com PCR inversa (ou digestão de restrição) no ponto de inserção. Os primers para PCR inversa estão listados na Tabela 1. Abaixo está um exemplo de protocolo de PCR usado no laboratório do autor (consulte a Lista de materiais para obter os materiais exatos usados neste protocolo).
- Misture a reação de PCR, perfazendo um volume final de 50 μl com água: a um tubo de PCR de parede fina, adicione a água, 25 μl de mistura principal 2x, 0,5 μl de cada um dos primers direto e reverso (estoque diluído de 20 μM, concentração final de 0,2 μM) e 1 ng de molde. Use as seguintes condições de ciclo: 98 °C por 30 segundos, 30 ciclos de 98 °C por 7 segundos e 68 °C por 2 min e uma extensão final a 72 °C por 10 min.
- PCR os genes de interesse para inserção nos plasmídeos linearizados contendo fragmentos de RN e RC. Execute a PCR como na etapa 1.2.1 com o tempo de extensão a 68 ° C. Use primers com saliências que contenham uma sequência de ligação flexível, como GGAGGTGGAGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT para (GGGGS) x2, e homologia de 15 pares de bases para as extremidades dos plasmídeos RN e RC linearizados para recombinação.
nota: As saliências do primer para as proteínas de interesse são apresentadas na Tabela 2 se forem usados os primers da Tabela 1 para linearizar a estrutura do plasmídeo.
- Digerir a reação de PCR com Dpn1 para eliminar o modelo de PCR. Adicione 0,5 μl de Dpn1 (20 U/μl) diretamente aos 50 μl da reação de PCR. Incubar a 37 °C por 1 hora e inativar o calor a 80 °C por 20 min. Se o modelo de fundo persistir em etapas posteriores, aumente a quantidade de enzima ou prolongue o tempo de digestão.
- Purifique os produtos de PCR por meio de uma coluna giratória, conforme descrito pelo fabricante.
- Execute uma reação independente de ligação para combinar um plasmídeo linearizado contendo um fragmento RN ou RC com o gene de interesse. Medir a concentração dos produtos purificados da PCR: combinar 50 ng de plasmídeo linearizado e 50 ng do gene em causa com 1 μl de pré-mistura enzimática e elevar o volume total para 5 μl com água desionizada. Incubar a 50 °C durante 15 min, colocar sobre gelo e adicionar 20 μl de tampão TE.
- Transforme plasmídeos recombinantes em bactérias competentes.
- Selecione 2-4+ (conforme desejado) colônias para a cultura O/N. Adicione 5 ml de caldo LB e 5 μl de canamicina (50 mg / ml de estoque) em um tubo de fundo redondo de polipropileno de 14 ml e adicione a colônia de bactérias selecionada com uma alça de inoculação esterilizada. Incubar a 37 °C O/N agitando a 225 rpm.
- Congele 1 ml de cultura O/N para estoque de glicerol e miniprepare o restante conforme descrito pelo fabricante.
- Execute o sequenciamento para determinar um bom clone. Se estiver usando os plasmídeos de clonagem na Lista de Materiais, use primers diretos e reversos M13 (em reações separadas) conforme necessário para obter a sequência completa da construção de fusão. Compare com a sequência esperada usando uma ferramenta de alinhamento como o BLAST do National Center for Biotechnology Information (NCBI) - http:// blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi.
- Transfira as construções verificadas por sequência para um plasmídeo de expressão por meio de uma reação de recombinase.
- Adicione 75 ng do plasmídeo de destino - como pcDNA para transfecções transitórias ou pLenti para embalagem lentiviral - e 50 ng do plasmídeo de clonagem recombinante a 1 μl de pré-mistura enzimática e aumente o volume total para 5 μl com água deionizada. Incubar a 25 °C por 1 hora e, em seguida, adicionar 5 μl de tampão TE.
nota: Para empacotamento lentiviral e geração estável de linhagens celulares, use um plasmídeo de destino diferente para cada construção, por exemplo, um com resistência à puromicina e outro com neomicina. Isso permite uma seleção dupla de células transduzidas. Considere também o promotor de cada um, como o promotor constitutivo do citomegalovírus (CMV) para altos níveis de expressão, ou CMV com o operador TetO para expressão regulada por doxiciclina ajustável.
- Transforme 5 μl em bactérias competentes e miniprepare os plasmídeos como nas etapas 1.2.6 a 1.2.8, mas usando o antibiótico apropriado (normalmente ampicilina).
- Determine a configuração ideal do BiFC.
- Plasmídeos de expressão co-transfecto em células U2OS (ou célula de escolha).
- Adicione 350 μl de DMEM sem vermelho de fenol e sem antibióticos suplementado com 10% de FBS em cada poço de uma lâmina de câmara de fundo de vidro # 1,5 de 8 poços. Placa de cerca de 7,5 x 104 células por poço para que as células sejam cerca de 70% -90% confluentes no dia seguinte.
- No dia seguinte ao plaqueamento, co-transfectar plasmídeos de expressão com diferentes configurações em cada alvéolo, utilizando o reagente preferido e conforme descrito pelo fabricante.
- Para cada alvéolo, adicionar 125 ng de cada plasmídeo de expressão a 50 μl de meio reduzido isento de soro num tubo de 0,6 ml e pipetar para cima e para baixo para misturar. Adicione 1 μl do reagente de transfecção no centro do tubo e diretamente no meio. Agite suavemente para misturar e deixe a reação descansar por 30 min.
- Reduza o meio em cada poço da lâmina da câmara pela metade. Adicione a mistura de transfecção gota a gota aos poços e agite suavemente para misturar. Incubar células a 37 °C e 5% de CO2 por 24-48 horas. Mude o meio no dia seguinte à transfecção.
- Células de imagem em um microscópio de fluorescência como no Protocolo 2 começando com a etapa 2.1.4.
nota: A amostra pode ser fotografada em um microscópio de fluorescência padrão se os níveis de expressão forem altos e a câmera for sensível o suficiente para a saída de fótons relativamente baixa de PAmCherry1. As moléculas PAmCherry1 reconstituídas podem ser ativadas com um conjunto de filtros ultravioleta (405 nm) antes da aquisição de imagens com um conjunto de filtros de excitação verde (561 nm).
- Quando aplicável, crie um controle negativo, por exemplo, introduzindo uma mutação pontual em uma das proteínas de interesse que interrompem a interação. Realize a mutagênese dirigida ao local no plasmídeo de clonagem da proteína a ser mutada e da configuração escolhida.
- Gere uma linhagem celular estável empacotando as construções em partículas virais e infectando células U2OS (ou linhagem celular de escolha). Considere um sistema de expressão induzível (tetraciclina) para que a expressão possa ser induzida antes da imagem se a irreversibilidade prolongada do BiFC for um problema ou se a expressão sintonizável for desejada.
cuidado: Trabalhar com vírus é classificado como Nível de Biossegurança 2. Embora as gerações recentes de sistemas de empacotamento viral tenham reduzido muito a probabilidade de produzir vírus competentes para replicação, alguns riscos ainda estão presentes. As referências podem ser encontradas em http://www.cdc.gov/ biossegurança/publicações/.
- Repita a etapa 1.2.10 usando um vetor de destino lenti- ou retroviral. Aumente a cultura O/N para 100 ml para uma preparação midiática e maior pureza dos plasmídeos.
- No Dia 1: Coloque cerca de 2 x 106 293T / 17 células em um prato de 10 cm para cada construção a ser embalada.
- No dia 2: Prepare uma reação de transfecção usando um reagente de transfecção de sua escolha e conforme descrito pelo fabricante.
- Preparar uma pré-mistura de plasmídeos de embalagem com concentrações finais de 250 ng/μl para os plasmídeos de embalagem 1 e 2 e de 100 ng/μl para a embalagem do plasmídeo 3 em água estéril. Adicionar 10 μl da pré-mistura do plasmídeo de enchimento e 2,5 μg do plasmídeo alvo a 1 ml de meio reduzido isento de soro num tubo de fundo redondo de polipropileno de 5 ml e pipetar para cima e para baixo para misturar. Adicione 20 μl de reagente de transfecção no centro do tubo e diretamente no meio.
- Agite suavemente para misturar e incubar em RT por 30 min. Remova cerca de metade do meio das células e adicione a mistura de transfecção gota a gota. Agite suavemente para misturar e incubar a 37 °C e 5% de CO2. Incubar 10 ml de meio por placa num tubo com a tampa solta para o equilíbrio da temperatura e do CO2.
- No dia 3: Troque suavemente o meio com o meio pré-incubado e devolva as células à incubadora. Incube outro tubo de mídia com a tampa solta. Nota: A sincício, ou a formação de grandes células multinucleadas, pode ser um sinal de que a embalagem está indo bem. No entanto, as células estão em um estado frágil e podem ser facilmente descoladas. Ao trocar a mídia, incline o pipetador para que fique na horizontal e adicione a mídia gota a gota em uma borda da placa.
- No dia 4: Colha o vírus removendo o meio com uma seringa e filtrando através de um filtro de tamanho de poro de 0,45 μm em um tubo limpo de 50 ml. Substitua cuidadosamente o meio pelo meio pré-incubado.
- No dia 5: Colher novamente como feito anteriormente no passo 1.5.3.3 e combinar o filtrado comum no mesmo tubo de 50 ml. Adicione 6 ml de concentrador de vírus a cada tubo e misture. Armazene a 4 °C por pelo menos 24 horas até que o vírus precipite.
nota: Dependendo da saúde das células, o vírus pode ser colhido uma terceira vez.
- Concentrar o vírus centrifugando a 1.500 x g durante 15 minutos a 4 °C. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 250 μl de meio. Os vírus podem ser usados imediatamente para infecção ou armazenados em alíquotas de 50 μl a -80 °C por até um ano.
- Coloque cerca de 3 x 105 células U2OS (ou alvo) por poço em uma placa de 6 poços (2 ml de DMEM com 10% de FBS por poço) para infecção, de modo que as células sejam cerca de 50% confluentes no momento da infecção.
- No dia seguinte, remova cerca de metade da mídia para que reste cerca de 1 ml. Coinfectar com 50 μl de vírus concentrado para cada construção. Adicionar 1 μl de polibreno (8 mg/ml) a cada alvéolo. Incubar a 37 °C e 5% de CO2. Troque o meio no dia seguinte e incube por mais um dia antes da seleção do antibiótico.
nota: A quantidade de vírus a ser adicionada pode variar dependendo da taxa de infecção desejada. Os vírus podem ser titulados usando qRT-PCR.
- Adicione antibióticos para selecionar células infectadas. Poços separados com células não infectadas que não viram o vírus são necessários como canários para testar a eficácia da seleção. Incube por 2 a 7 dias ou até que a seleção seja concluída.
nota: As concentrações efetivas devem ser tituladas inicialmente, mas geralmente são de 1,0 μg/ml para puromicina e 1,0 mg/ml para neomicina.
- Expanda as células para um prato maior de 10 cm e prossiga para o Protocolo 2.
2. Imagem de células fixas
- Preparar uma amostra para imagem
- Limpe uma lâmina de câmara de fundo de vidro # 1,5 de 8 poços adicionando 250 μl de NaOH 1 M por pelo menos 1 hora e lave bem com PBS.
nota: As corrediças da câmara não tratadas normalmente resultam em alto sinal de fundo. Além disso, as células podem ser sensíveis ao NaOH residual e a falha em limpar completamente a superfície do vidro (até 10 lavagens) pode dificultar a adesão celular. Se necessário, incube a lâmina da câmara limpa com PBS O/N após a lavagem. Para linhagens celulares sensíveis, o plaqueamento em uma densidade mais alta (por exemplo, com 50% -60% de confluência inicial) pode ajudar.
- Plaquear cerca de 5,5 x 104 das células de expressão estável de U2OS por poço em 350 μl de DMEM sem vermelho de fenol com 10% de FBS para que as células sejam saudáveis e não excessivamente confluentes durante a imagem.
- Realize os tratamentos necessários para o experimento, como adicionar tetraciclina para induzir a expressão de proteínas.
- Fixe as células imediatamente antes de fazer a imagem.
- Antes da fixação, prepare uma solução fresca de paraformaldeído (PFA) - PFA a 3,7% em 1x PHEM com glutaraldeído (GA) a 0,1%. Para 10 ml de solução de PFA, pesar 0,37 g de PFA e transferir para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Adicionar 1 ml de água destilada e 30 μl de NaOH 1 M e vórtice. Aqueça a 70 °C e vortex a cada 1-2 min até que o PFA esteja completamente dissolvido.
- Transfira o PFA dissolvido para um tubo cônico de 15 ml e adicione 3,8 ml de água destilada, 5 ml de tampão PHEM 2x, 20 μl de glutaraldeído a 25% e vórtice para misturar. Estoque, 2x tampão PHEM é 120 mM PIPES, 50 mM HEPES, 20 mM EGTA e 16 mM MgSO4, com pH ajustado para 7,0 com 10 M KOH. Esta solução fixadora pode ser armazenada a 4 °C por vários dias.
cuidado: PFA e GA são perigosos. Prepare a solução em uma capela e use equipamento de proteção adequado ao manusear os dois produtos químicos. Evite a inalação ou o contato direto com a pele.
- Remova o meio de crescimento. Lave rapidamente com 500 μl de PBS e adicione 250 μl do fixador PFA por alvéolo. Incubar as células durante 20 min à RT.
- Remova o fixador PFA da amostra e adicione 350 μl de PBS ou tampão de imagem (100 mM Tris com 30 mM NaCl e 20 mM MgCl2, pH 8,5) por poço.
- Vórtice de partículas de ouro de 100 nm para quebrar agregados e adicionar 35 μl por poço (diluição final de 10x) para rastrear o desvio do estágio durante a geração de imagens.
- Adquira imagens
- Ligue o microscópio. Ligue os lasers de 405 e 561 nm, mas mantenha as persianas (internas ou externas) fechadas neste ponto. Ligue a câmera EMCCD e deixe-a esfriar. Certifique-se de que os filtros de 561 nm estejam no lugar.
- Abra o software de aquisição e defina o tempo de exposição para 100 ms e o ganho EMCCD para 300 (intervalo de 1 a 1.000).
- Adicione óleo de imersão à objetiva e prenda a amostra ao estágio do microscópio.
- Com um campo claro ou o laser de 561 nm ligado (~1 kW/cm2 ), coloque a amostra em foco.
- Para imagens de Ras e outras proteínas de membrana, use uma objetiva TIRF apocromática de 60X com uma abertura numérica de 1,49 e coloque o microscópio na configuração TIRF. Ajuste o laser de excitação para que fique descentralizado ao atingir a abertura traseira da objetiva TIRF; Isso faz com que o laser desvie ao atingir a amostra. Continue ajustando o laser até que o ângulo crítico seja alcançado e o laser esteja sendo refletido de volta. Procure uma célula para criar uma imagem com várias partículas de ouro à vista. Defina uma região de interesse que inclua a célula (ou uma região dentro da célula) e as partículas de ouro.
Observação: O TIRF diminui a profundidade de penetração do laser de excitação e reduz o sinal de fundo fora de foco. Além disso, a correção de desvio provavelmente será mais precisa quando mais partículas de ouro estiverem à vista.
- Se disponível, ative o sistema de foco automático para corrigir o desvio de sample na direção z. Caso contrário, ajuste o foco manualmente durante toda a aquisição se a imagem ficar fora de foco.
- Comece a aquisição com o laser de 405 nm desligado e o laser de 561 nm ligado (~1 kW/cm2) caso já esteja ocorrendo ativação suficiente (normalmente se os níveis de expressão forem altos). Caso contrário, ligue o laser de 405 nm na configuração de potência de fábrica mais baixa (0.02 mW ou 0.01 W/cm2) e aumente gradualmente (0.1 mW de cada vez) conforme necessário até que haja várias dezenas de moléculas por quadro ou de modo que as moléculas individuais estejam bem separadas.
- À medida que a aquisição de dados continua, aumente gradualmente a potência do laser de 405 nm para manter a densidade do ponto aproximadamente constante. Nota: Com uma potência de excitação inferior a 405 nm, alguns PAmCherry1 já podem ser ativados. À medida que essas moléculas fotobranqueiam, a população de moléculas PAmCherry1 fotoativáveis restantes diminui, exigindo um fluxo de fótons mais alto para manter a mesma densidade de moléculas que emitem fluorescência em cada quadro.
- Continue a aquisição de imagens até que a alta potência de 405 nm (2,5 – 10 W/cm2) não ative mais eventos de ativação.
nota: O tempo total de aquisição depende do nível de expressão e da eficiência da complementação.
Tabela 1. Primers para linearização de plasmídeos de clonagem contendo fragmentos de PAmCherry1. Os plasmídeos de clonagem contendo RN e RC podem ser linearizados com PCR inversa no ponto de inserção no terminal N ou C dos fragmentos. As sequências são listadas de 5 'a 3'.
| Sequência de primer (5' a 3') |
| Plasmídeo de clonagem para inserção no reverso N-terminal | CATGGTACCGAGCTCCTGCAGC |
| RN no N-terminal para a frente | GTGAGCAAGGGCGAGGAGGATAA |
| RC no N-terminal para a frente | GGCGCCCTGAAGGGCGA |
| Plasmídeo de clonagem para inserção no terminal C para a frente | TAAAAGGGTGGGCGCGCC |
| RN do terminal C reverso | GTCCTCGGGGTACATCCGCTC |
| RC do terminal C reverso | CTTGTACAGCTCGTCCATGCCG |
Tabela 2. Saliências para primers de genes de interesse que correspondem aos primers da Tabela 1.
Os 15 pares de bases de homologia para a reação independente de ligação são gerados a partir de saliências de primer. Além disso, as saliências incluem a sequência de um vinculador flexível (GGGGS)x2. A sequência do ligante flexível pode ser adicionada aos primers na Tabela 1. As sequências são listadas de 5 'a 3'.
| Saliências para os primers do gene de interesse (5' a 3') |
| Inserção N-terminal RN ou RC para frente | GAGCTCGGTACCATG |
| Inserção N-terminal RN reverso | ACTTCCACCTCCACCACTACCTC
CACCTCCCTCGCCCTTGCTCAC |
| Inserção N-terminal RC reversa | ACTTCCACCTCCACCACTACCTC
CACCTCCGCCCTTCAGGGCGCC |
| Inserção C-terminal RN para frente | ATGTACCCCGAGGACGGAGGTGG
AGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT |
| Inserção C-terminal RC para frente | GACGAGCTGTACAAGGGAGGTGG
AGGTAGTGGTGGAGGTGGAAGT |
| Inserção C-terminal RN ou RC reversa | GCGCCCACCCTTTTA |