$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Rotulagem de SBDS-FlAsH com o corante fluorescente FlAsH 4',5'-bis(1,3,2 ditioarsolano-2-il) fluoresceína
- Misturar 3 nmol da proteína SBDS-FlAsH (a etiqueta FlAsH corresponde ao motivo da tetracisteína Cys-Cys-Pro-Gly-Cys-Cys geneticamente modificado no terminal C da proteína SBDS recombinante) com 3 nmol do corante fluoresceína 4',5'-bis(1,3,2 ditioarsolano-2-il) em 5 μl de volume de tampão anisotropia (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 10% de glicerol, 5 mM β-mercaptoetanol).
- Deixe a reação prosseguir por 8 horas a 4 ° C. Dialise a amostra contra o tampão anisotropia durante a noite para remover o corante livre.
- Use a lei de Lambert-Beer para quantificar a % de proteína marcada. Medir a absorvância a 280 nm e 508 nm num espectrofotómetro utilizando uma cubeta de quartzo de volume adequado. nota: Considere os seguintes coeficientes de absorção molar (M-1 cm-1):
Equação 1
- Calcule a concentração da proteína SBDS-FlAsH marcada usando a Equação 2.
Equação 2
- Calcule a concentração de proteína SBDS total usando a Equação 3, substituindo o CSBDS-FlAsH calculado da etapa anterior.
Equação 3
- Calcule a porcentagem de proteína marcada usando a Equação 4.
Equação 4
2. Experimentos de anisotropia de fluorescência
>NOTA: Os experimentos de anisotropia foram realizados em um espectrofluorômetro equipado com uma caixa de ferramentas de polarização e a coleta de dados foi realizada usando o programa de anisotropia fornecido no software do equipamento. O comprimento de onda de excitação foi definido em 494 nm com uma largura de banda espectral de 8 nm e a emissão foi registrada usando um filtro passa-banda de 530±25 nm. As medições foram feitas a 25 °C em uma cubeta de 200 μl com um comprimento de caminho de 5 mm.
- Em uma cubeta de fluorescência, coloque 200 μl de 30 nM SBDS-FlAsH em um tampão de anisotropia e titule 2 μl de 30 μM EFL1. Misture bem e deixe a reação repousar por 3 minutos antes de medir o valor de anisotropia.
- Repita a etapa 2.1 até que um volume total de 40 μl de EFL1 tenha sido adicionado.
3. Análise dos dados
- Ajuste os dados ao modelo de associação apropriado usando um algoritmo de regressão de mínimos quadrados não linear. As equações para os modelos de ligação mais comuns são apresentadas na Tabela 1.
- Avalie o melhor modelo que descreva a interação entre as proteínas, inspecionando os resíduos do ajuste. Apoie o modelo escolhido com experimentos adicionais.
Tabela 1. Modelos comuns de ligação de interação proteína-proteína e as equações matemáticas que os descrevem.
