Ensaio de Deslocamento de Mobilidade Eletroforética para Detecção de Complexos de Fator de Transcrição-DNA

Resumo

Fonte: Hsieh, Y. W. et al., Um protocolo otimizado para ensaio de mudança de mobilidade eletroforética usando oligonucleotídeos marcados com corante fluorescente infravermelho. (2016)

Neste vídeo, demonstramos o ensaio de deslocamento de mobilidade eletroforética para detectar interações proteína-DNA usando sondas de DNA marcadas com fluorescência infravermelha. Quando a proteína se liga à sonda de DNA, ela forma um grande complexo que migra lentamente e aparece como uma banda deslocada no gel.

Protocolo

1. Reação de ligação e eletroforese

1. Prepare 1 mL de tampão de ligação 5x misturando 50 μL de Tris-HCl 1 M, pH 7,5; 10 μL de NaCl 5 M; 200 μL de KCl 1 M, 5 μL de 1 M MgCl₂, 10 μL de EDTA 0,5 M, pH 8,0; 5 μL de DTT 1 M; 25 μL de 10 mg / mL BSA, e 695 μL de ddH₂O.
   nota: O buffer de ligação 5x pode ser aliquotado e armazenado a -20 °C. Outro ponto a considerar é que diferentes fatores de transcrição terão diferentes modificações no buffer de ligação.
2. Logo antes de configurar as reações de ligação, execute previamente o gel de poliacrilamida nativa a 5% em 0,5x TBE + 2,5% de glicerol para remover todos os vestígios de persulfato de amônio a 80 V por 30 a 60 minutos ou até que a corrente não varie mais com o tempo.
3. Configure a reação de ligação no volume final de 20 μL.
   1. Misture 4 μL de tampão de ligação 5x, 80 - 200 ng de proteína A purificada (em 50% de glicerol, ou seja, SOX-2), 1 μL de sonda conjugada com corante 0,1 μM (concentração final: 5 nM) e ddH₂O.
   2. Opcional: Quando forem necessários concorrentes de sonda fria, adicione várias concentrações (2x, 10x, 25x, 50x, 100x, etc.) de sondas frias.
   3. Opcional: Quando a interação entre as proteínas A e B (ou seja, SOX-2 e LIM-4) for testada, adicione 80 - 200 ng de proteína B purificada (em 50% de glicerol, ou seja, LIM-4).
   4. Opcional: Quando a preparação de extrato nuclear for usada e a ligação específica da proteína A for validada, adicione um anticorpo específico para a proteína A (ou seja, anti-6xHis, anti-FLAG, etc.).
   5. Incubar em R/T no escuro por 15 min.
4. Carregue todas as reações de ligação no gel e execute o gel a 10 V/cm até a distância desejada.

2. Exames de imagem

NOTA: O gel foi escaneado diretamente nas placas de vidro com um sistema avançado de imagem infravermelha. Portanto, o gel pode ser resolvido e escaneado repetidamente (Figuras 1C e 2). Um sistema de imagem fluorescente de infravermelho próximo principalmente para Western blots também foi testado para escanear o gel, mas apenas o sistema avançado de imagem infravermelha foi capaz de escanear o gel com boa resolução. A metodologia descrita é específica para um determinado software de imagem infravermelha, embora outros pacotes de software possam ser usados.

1. Limpe a base do scanner com ddH₂O e seque bem antes de digitalizar. Seque as placas de vidro do gel e coloque as placas que contêm o gel na base do scanner.
2. Abra o software de imagem infravermelha e vá para a guia 'Adquirir'. Quando a placa mais fina (1 mm) for colocada na base do scanner, use as configurações de Canal: 700, Intensidade: Automático, Resolução: 169 μm, Qualidade: média e Deslocamento de foco: 1,5 mm. Quando a placa mais espessa (3 mm) for colocada no leito do scanner, use as configurações de Canal: 700, Intensidade: Automático, Resolução: 84 μm, Qualidade: média e Deslocamento de foco: 3,5 mm. O deslocamento do foco depende da espessura da placa de vidro.
3. Selecione a área que o gel ocupa no scanner. Clique em 'Iniciar' para iniciar a verificação.

Resultados

Figura 1. fEMSA usando oligonucleotídeos marcados com corante fluorescente infravermelho. (A) Fluxograma da fEMSA. (B) O efeito do corante azul de bromofenol, laranja G e dI-dC (1 μg) no fEMSA. 5 nM de sonda 5'Dye-LIM-4/SOX-2 foram usados. (C) fEMSA mostrando especificidade de ligação de 6xHis-SOX-2^G73E ao local alvo SOX-2 do elemento LIM-4 / SOX-2. 5 nM de sonda 5'Dye-LIM...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Solução de Acrilamida / Bis a 30%, 37,5: 1	Bio-Rad	1610158	A acrilamida é prejudicial e tóxica.
Albumina de soro bovino grau de biologia molecular	Biolabs da Nova Inglaterra	B9000S
Oligos de DNA marcados com 5'IRDye700	Tecnologias integradas de DNA	Oligo de DNA personalizado	Estes são referidos como oligos de DNA marcados com corante 5'Dye ou infravermelho marcado com corante fluorescente no manuscrito. A empresa sintetizará de forma personalizada oligonucleotídeos de DNA marcados com 5 'IRDye. Requer síntese em escala mínima de 100μM e purificação por HPLC.
Célula de eletroforese vertical Mini-PROTEAN	Bio-Rad	1658000FC	dispositivo
Sistema de imagem infravermelha Odyssey CLx	LI-COR Biotecnologia	Sistema de imagem infravermelha Odyssey CLx	dispositivo
Sistema de imagem Odyssey Fc	LI-COR Biotecnologia	Sistema de Imagem de Modo Duplo Odyssey Fc	dispositivo
Software Image Studio (versão 4.0)	LI-COR Biotecnologia	Software Image Studio	software
Laranja G	Sigma-Aldrich	O3756-25G	químico
6x corante de carregamento laranja			0,25% Laranja G; 30% Glicerol
0,5x TBE			Trisborato de 45 mM; EDTA de 1 mM
1x TE			10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH 8,0
1x STE			100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0; 1 mM EDTA
5x Buffer de ligação			50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH 8,0; 5 mM DTT; 250 ug / ml BSA