Todos os procedimentos envolvendo modelos animais foram revisados pelo comitê institucional local de cuidados com animais e pelo conselho de revisão veterinária JoVE.
1. Purificação de células de linhagem de oligodendrócitos positivos para PDGFRα do cérebro de camundongos (modificado a partir de protocolos de imunopanning descritos anteriormente)
- Preparação de uma placa de imunopanning para seleção de células positivas para PDGFRα e 2 placas para depleção de células endoteliais e microglia.
nota: Observe que as placas de Petri, mas não as placas de cultura de células, funcionam para experimentos de imunopanning; Se as células purificadas forem usadas para cultura, as etapas de imunopanificação devem ser realizadas no gabinete de biossegurança
- Cubra uma placa de Petri de 10 cm com 30 μL de IgG anti-rato caprino em 10 mL de pH 9,5, 50 mM de Tris-HCl durante a noite a 4 °C. Agite a placa para certificar-se de que as superfícies das placas estão uniformemente e totalmente cobertas pela solução de revestimento.
- Prepare a solução de anticorpo PDGFRα diluindo 40 μL de anticorpo anti-PDGFRα de rato com 12 mL de solução salina tamponada com fosfato de Dulbecco (DPBS) contendo 0,2% de BSA.
- Após 3 lavagens de placa revestida com IgG com 10 mL 1x DPBS cada, incube a placa revestida com IgG com solução de anticorpo PDGFRα em temperatura ambiente por 4 h.
- Lave a placa revestida com anticorpos anti-PDGFRα de rato 3 vezes com 10 mL 1x DPBS cada. Adicione suavemente a solução de DPBS ao longo da parede lateral da placa e não perturbe as superfícies revestidas.
- Revestir 2 novas placas de Petri de 15 cm para a depleção de células endoteliais e microglia com 20 mL de DPBS contendo 2,3 μg/mL de lectina 1 de Banderiaea simplicifolia (BSL-1) por 2 h.
- Lave as placas revestidas com BSL-1 3 vezes com 20 mL 1x DPBS. Adicione suavemente a solução de DPBS ao longo da parede lateral das placas e não perturbe as superfícies revestidas.
- A purificação de células de linhagem de oligodendrócitos positivos para PDGFRα é modificada a partir de métodos publicados anteriormente.
- Dissecar os tecidos corticais de 2 cérebros de camundongos pós-natal dia 7 (P7) de acordo com protocolos publicados anteriormente.
- Dissocie os tecidos para gerar uma suspensão de célula única com um kit de dissociação de tecido neural (P) de acordo com as instruções detalhadas do fabricante.
- Cortar brevemente os tecidos corticais dissecados em pedaços com um bisturi e submetê-los a uma digestão enzimática a 37 °C. Após a digestão, dissocie manualmente as peças com pipetas Pasteur de vidro polido a fogo em uma suspensão de célula única.
- Centrifugue a suspensão de célula única a 300 x g por 10 min à temperatura ambiente e suspenda o pellet celular usando 15 mL de tampão de imunopanning (o tampão de imunopanning é DPBS com 0,02% de BSA e 5 μg / mL de insulina).
- Incube a suspensão unicelular de 2 cérebros de camundongos sequencialmente em 2 placas revestidas com BSL-1 por 15 min em temperatura ambiente com agitação suave da placa a cada 5 min para garantir uma melhor depleção da microglia e das células endoteliais.
- Agite suavemente a placa para coletar as células não aderentes na suspensão celular e incube-as na placa revestida com anticorpo PDGFRα de rato por 45 min em temperatura ambiente.
- Após a incubação da suspensão celular na placa revestida com anticorpo PDGFRα de rato, gire suavemente a placa para coletar a suspensão celular e enxágue a placa 8 vezes com DPBS para se livrar das células não aderentes. Adicione suavemente a solução de lavagem ao longo da parede lateral da placa e agite a placa várias vezes para se livrar das células não aderentes.
- Separe as células da placa revestida com anticorpo PDGFRα de rato usando 4 mL de tratamento com solução de descolamento celular por 10 min a 37 ° C. Agite a placa para desalojar as células aderentes.
- Coletar os OPCs purificados por centrifugação a 300 x g à temperatura ambiente, suspender o pellet celular com 2 mL de meio de cultura de células OPC e contar as células usando azul de tripano e um hemocitômetro (500 mL de meio de cultura de células em meio DMEM/F12 contendo 5 mL de solução de penicilina-estreptomicina (P/S), 5 mL N2, 10 mL B27, 5 μg/mL de insulina, 0,1% de BSA, 20 ng/mL de bFGF e 10 ng/mL de PDGFRα).
- Validação da pureza dos OPCs após imunopanning.
- Para avaliar o enriquecimento de OPCs após imunopanning, use alguns dos OPCs purificados para extração de RNA com uma extração à base de tiocianato de guanídio de acordo com as instruções do fabricante.
- Realize qRT-PCR usando master mix de corante verde fluorescente para verificar o enriquecimento da expressão de PDGFRα em OPCs purificados em comparação com células cerebrais dissociadas de acordo com os materiais publicados anteriormente.
- Além disso, semeie alguns OPCs purificados nas placas de 24 poços revestidas com Poli-D-Lisina para imunocoloração com anticorpo anti-NG2 condroitina sulfato proteoglicano (NG2) conforme materiais publicados anteriormente.
2. Preparação de ChIP de baixa célula e construção de biblioteca ChIP para sequenciamento de alta taxa de transferência
- Olig2 Preparação de ChIP de baixa célula com um sistema de sonicação disponível comercialmente e um kit de ChIP de baixo número de células disponível comercialmente (consulte a Tabela de Materiais) seguindo os procedimentos padrão detalhados das instruções do fabricante.
- Após o descolamento da placa revestida com anticorpos anti-PDGFRα de rato e a contagem de células com azul de tripano e um hemocitômetro, colocar 20.000 OPCs purificados em 1 mL de meio de cultura de células OPC para cada reação de ChIP.
- Adicione 27 μL de formaldeído a 36,5% para fixar a suspensão celular por 10 min em temperatura ambiente.
cuidado: Observe que o formaldeído deve ser usado na capela de exaustão química por razões de segurança.
- Pare a reticulação de DNA-proteína com 50 μL de glicina 2,5 M por 5 min à temperatura ambiente.
nota: Todas as etapas devem ser realizadas no gelo ou em uma câmara fria a 4 °C a partir deste ponto.
- Lave os grânulos de células reticuladas com 1 mL de solução salina balanceada de Hanks gelada (HBSS) com coquetel de inibidores de protease e obtenha as células peletizadas por uma centrífuga pré-resfriada a 300 x g a 4 ° C.
- Lisar o pellet celular em tampão de lise completo de 25 μL por 5 min em ice.
nota: Agite o tubo para suspender as células no tampão de lise.
- Suplementar o lisado celular com 75 μL de HBSS gelado contendo coquetel inibidor de protease e cisalhar a cromatina do lisado celular por sistema de sonicação pré-resfriado com 5 ciclos de programa de 30 s ON e 30 s OFF. Sempre sonicar 6 tubos juntos e certifique-se de que os tubos de equilíbrio contenham 100 μL de água.
- Após a tosquia, centrifugar a 14.000 x g durante 10 min a 4 °C e recolher o sobrenadante num novo tubo após centrifugação.
- Dilua 100 μL de cromatina cisalhada com um volume igual de tampão ChIP completo gelado com o inibidor de protease.
- Economize 20 μL da cromatina cortada diluída como amostra de controle de entrada.
nota: A amostra de controle de entrada também é necessária como comparação com a amostra imunoprecipitada Olig2 para identificar o DNA imunoprecipitado do anticorpo Olig2.
- Adicionar 1 μL de anticorpo anti-olig2 de coelho a 180 μL da cromatina cisalhada diluída e incubar o tubo de reação em uma roda giratória a 40 rpm por 16 h a 4 °C.
nota: Execute esta etapa em uma câmara fria.
- Para cada reação de ChIP, lave 11 μL de grânulos revestidos com proteína magnética A com 55 μL de tampão de lavagem de grânulos e coloque o pellet de grânulos em 11 μL de tampão de lavagem de grânulos após 2 lavagens.
nota: Execute esta etapa em uma câmara fria.
- Para cada reação ChIP, adicione 10 μL de esferas revestidas com proteína A pré-lavadas ao tubo de reação ChIP. Execute esta etapa em uma câmara fria.
- Incubar o tubo de reacção ChIP a 4 °C durante mais 2 h numa roda rotativa.
- Coloque o tubo de reação ChIP no rack magnético por 1 min.
nota: Execute esta etapa em uma câmara fria.
- Remova o sobrenadante e não desaloje o pellet do cordão.
- Lave o pellet de esferas com 100 μL para cada um dos 4 tampões de lavagem, respectivamente, por 4 min em uma roda giratória a 4 °C.
- Após as lavagens, adicionar 200 μl de tampão de eluição ao sedimento de esferas e incubar o tubo de reação ChIP a 65 °C durante 4 h para inverter a proteína de ligação cruzada-ADN.
- Além disso, adicione 180 μL de tampão de eluição a 20 μL de amostra de controle de entrada e incube a 65 ° C por 4 h para reverter também a proteína de reticulação do DNA.
- Adicione 200 μL 25:24:1 (v/v) de mistura de fenol, clorofórmio e álcool isoamílico a cada tubo de reação ChIP.
- Vortex vigorosamente por 1 min e centrifugue a 13.000 x g por 15 min em temperatura ambiente. Transfira a fase superior para um novo tubo.
- Adicione 40 μL de solução de acetato de sódio 3 M, 1.000 μL de etanol 100% e 2 μL de precipitante de glicogênio covalentemente ligado a um corante azul a cada tubo de reação ChIP durante a noite a -20 ° C.
- Centrifugue a 13.000 x g por 20 min a 4 °C.
- Descarte o sobrenadante, lave com 500 μL de etanol frio a 70% e centrifugue a 13.000 x g por 20 min a 4 ° C.
- Descarte o sobrenadante, mantenha o pellet seco por 10 min e dissolva o pellet com 50 μL de água.
- Construção de biblioteca ChIP para sequenciamento de alto rendimento
- Limpe e concentre o DNA ChIP com um kit de limpeza de acordo com as instruções do fabricante.
- Quantificar a amostra de ChIP com um pico-verde de acordo com as instruções do fabricante.
- Use um kit ChIP-seq para T-tailing, replicação e tailing, comutação e extensão de modelos, adição de adaptadores e amplificação, seleção de tamanho de biblioteca e purificação de acordo com as instruções do fabricante.
- Após a desnaturação do dsDNA, desfosforile a extremidade 3' do ssDNA pela fosfatase alcalina do camarão e adicione uma cauda poli (T) ao ssDNA pela desoxinucleotidil transferase terminal.
- Recozer o DNA Poly (dA) Primer para o modelo ssDNA para a replicação do DNA e troca de modelo.
- Após a troca de modelo, amplifique a biblioteca ChIP-seq por PCR com os primers direto e reverso para indexação.
- Selecione a biblioteca ChIP-seq amplificada por PCR com fragmentos variando de 250 a 500 pb por esferas paramagnéticas pela opção 2 para seleção de tamanho duplo.
- Examine a qualidade da biblioteca ChIP-seq selecionada usando um dispositivo de eletroforese capilar de chip microfluídico.
