1. Microscopia de Polarização
- Para iluminação a laser de campo amplo, focalize uma linha de 638 nm de um laser de diodo contínuo (40 mW) na abertura da fibra óptica multimodo para limpeza do feixe. Monte um polarizador linear na saída da fibra para definir a polarização da luz laser.
- Bloquear a componente de excitação da luz emitida com um espelho dicróico (corte de 640 nm) e um filtro passa-banda (passa-banda 700/75).
- Deixe o sinal de fluorescência passar por um divisor de feixe polarizador, que divide a luz emitida em seus componentes polarizados perpendiculares e paralelos. Em seguida, focalize o feixe não refletido (componente paralelo) e o feixe refletido (componente perpendicular) com uma lente acromática de 200 mm de distância focal no chip de uma câmera EM-CCD retroiluminada (Figura 1b e 1c). Use um espelho para ajustar a direção do feixe perpendicular em direção à lente.
2. Projeto e teste de oligômero de DNA de referência marcado com fluorescência
- Determinar a sequência central do DNA de referência: o método é baseado em um ensaio competitivo que mede a constante de dissociação (KD2) entre um fator de transcrição e um oligômero de DNA concorrente não marcado que compete pela ligação com um DNA marcado com fluorescência cuja afinidade com o TF atua como referência (KD1). A sequência de consenso obtida de outras fontes, como pegada DNase ou 1-híbrido bacteriano, pode servir como ponto de partida.
nota: Como regra geral, um DNA de referência adequado tem uma diminuição de 3 a 7 vezes na afinidade de ligação ao TF em comparação com a sequência de consenso.
- Meça por HiP-FA o KD1s de 2-3 mutações únicas provisórias da sequência de consenso derivada na etapa anterior. Tente alterar posições em sequências de consenso que não sejam muito específicas para evitar a perda completa da vinculação.
nota: É importante que a sequência de referência seja vinculada ao fator de transcrição de interesse (usamos neste protocolo o Giant Gt), mas não muito fortemente, para que os concorrentes mais fracos possam superá-lo em altas concentrações.
- Estenda o motivo central (8-12 pares de bases geralmente) para um comprimento de 16 pares de bases ou mais, adicionando uma sequência simetricamente flanqueada em ambos os lados (adicione correntes laterais para encadernação adequada). Se necessário (para domínios de ligação mais longos, por exemplo), use sequências mais longas (até ~50 pares de bases de comprimento foram testados com o ensaio HiP-FA).
cuidado: Tenha cuidado para não adicionar bases que devem criar locais de ligação ectópica. Use ferramentas computacionais que prevejam locais de ligação de PWMs disponíveis para facilitar esse processo (por exemplo, PySite).
- Como DNA de referência marcado, ordene os oligômeros que são marcados com fluorescência na fita direta ou reversa na extremidade 3 'ou 5'. Use, por exemplo, Cy5, Bodipy-650 ou qualquer outro corante adequado a uma concentração de 10 μM (estoque de 100 μM 10x) em água e dilua passo a passo conforme descrito na etapa 3.1.
- Prepare 500 mL de tampão de ligação 1x adicionando tampão fosfato de potássio 33 mM (pH = 7,0), NaCl 90 mM e detergente não iônico 0,01% em água destilada. Prepare também o tampão de ligação 3x, que contém os mesmos componentes, exceto em concentrações triplas. Se estiver usando o buffer de ligação 3x como solução estoque para o buffer de ligação 1x, prepare volumes > 500 mL; caso contrário, prepare 250 mL.
nota: Essa composição foi otimizada para estabilidade do fator de transcrição e para prevenir a dimerização da glutationa S-transferase (GST).
- Meça com a configuração de microscopia descrita na etapa 1 o FA de 200 μL de tampão de ligação contendo DNA de referência marcado com 0,8 nM na presença de diferentes quantidades de TF em uma placa de microscopia de fundo de vidro de 96 poços (5-6 poços com diferentes concentrações de TF) para determinar a concentração de TF a ser usada. Realizar uma série de titulações com quantidades crescentes de TF e escolher para o ensaio a concentração para a qual a curva atinge um platô, indicando a ligação completa do oligômero de referência do DNA.
nota: A concentração ótima de TF depende dos valores das constantes de dissociação TF-DNA. Geralmente, KDs mais baixos requerem concentrações mais baixas.
3. Recozimento de oligômeros
- Para recozer os oligômeros de DNA do DNA de referência marcado (sequência determinada na etapa anterior), misture 7 μL de uma solução de DNA de fita simples direta marcada com corante 10 mM e 7 μL de uma concentração de 10 mM de seu complemento reverso não marcado em 186 μL de água.
- Para as sequências de ADN concorrentes, misturar 20 μl de soluções de 100 mM (em água, fornecidas pelo fabricante) de ADN de fita simples direta com 20 μl de 100 mM do ADN de fita simples reverso correspondente para cada sequência concorrente individual a medir.
- Execute o recozimento separadamente em um ciclador de PCR padrão, aquecendo as soluções a 70 ° C por 3 min e diminuindo a temperatura para RT a uma taxa de 0,1 K / s. Se a máquina de PCR usada não suportar gradientes de temperatura nessa taxa, basta fazer incubações passo a passo com temperaturas decrescentes (foram testados 99 ciclos de 3 s com -0,4 K por ciclo).
4. Preparação do gel
NOTA: A seção a seguir explica a preparação de dois tipos diferentes de géis: 1) os poços de titulação contêm géis com proteína e são usados para determinar osKDs para as respectivas sequências de DNA concorrentes e 2) os poços de calibração fazem uso de NB para determinar a concentração de DNA em cada ponto de tempo e altura de aquisição. O foco está na preparação do experimento em uma placa de 96 poços, mas os volumes correspondentes para um formato de placa de 384 poços também são indicados.
- Dissolva a agarose de baixo ponto de fusão a 0,5% p / v no tampão de ligação, fervendo-o em um forno de micro-ondas de laboratório. Após a dissolução completa, ajuste o volume novamente com ddH2O para compensar a possível evaporação.
nota: Por conveniência, prepare um estoque de 10-20 alíquotas de 10 mL dos géis e derreta-os a 75 ° C quando necessário. Os estoques de gel podem ser armazenados em RT.
cuidado: Tenha cuidado para evitar o superaquecimento da solução de gel no forno de micro-ondas. Intervalos de tempo de aquecimento curtos com agitação entre eles são preferíveis.
- Para preparar os poços de titulação e calibração, primeiro derreta duas alíquotas de estoque de gel de 10 mL a 75 °C sob agitação.
- Use 240 μL (incluindo 20% de sobrecarga) para cada concorrente (n = número de sequências concorrentes).
- Use o mesmo volume de gel para o poço de calibração NB para garantir uma temperatura e viscosidade iguais de ambos os géis.
- Em seguida, regule a temperatura para 35 °C e aguarde que a temperatura se equilibre.
- Para os poços de titulação, adicione 1,4 nM (concentração final) de DNA de referência hibridizado (obtido na etapa 3), proteína TF (concentração final CTF = 20-60 nM, conforme determinado na etapa 2.6), DTT (0,2 mM) e tampão de ligação em um volume total de n x 200 μL ou n x 13 μL em um formato de placa de 96 ou 384 poços, respectivamente (mais sobrecarga). Misture bem invertendo/agitando (não vórtice).
- Adicione lentamente 200 μL por poço em formato de placa de 96 poços (13 μL/poço para 386 poços) da solução de gel preparada na etapa anterior nos poços de titulação da placa do poço.
- Para os poços de calibração, primeiro, adicione 5 nM NB ao gel derretido fora dos poços (volume total dependendo do formato da placa do poço usado e do número de poços de calibração; geralmente 5-6 por placa de poço é suficiente).
- Pipete 200 μL (13 μL para o formato de placa de 384 poços) de gel contendo NB lentamente dentro dos poços de titulação da placa do poço e certifique-se de evitar bolhas de ar.
nota: O uso de pipetas eletrônicas ou robótica aumenta significativamente a reprodutibilidade.
- Deixe o gel solidificar por 10 min em RT e outros 10 min a 4 ° C (remova a condensação do vidro depois, se necessário). Certifique-se de realizar todas essas etapas em uma superfície perfeitamente horizontal para evitar superfícies de gel não homogêneas.
nota: Os géis contendo proteínas são geralmente estáveis por pelo menos várias horas a 4 °C.
5. Adicionando a solução de DNA do concorrente
NOTA: As seguintes soluções devem ser preparadas antes de iniciar a titulação e são adicionadas sobre os poços de calibração e titulação simultaneamente.
- Adicione o DNA de referência marcado recozido e a proteína em tampão de ligação 3x em concentrações 3 vezes maiores do que as alíquotas de estoque de gel.
- Misturar 20 μl da solução obtida com 40 μl de cada solução de ADN concorrente recozida obtida no passo 3.
- Para cada poço de calibração, misture 20 μL de tampão de ligação 3x contendo solução NB de 15 mM com 40 μL de DNA concorrente recozido (qualquer sequência do mesmo comprimento é adequada).
nota: Para as placas de 384 poços, use 21 μL em vez de 60 μL no total.
- Opcionalmente, verificar espectroscopicamente a homogeneidade dos níveis de altura do gel nos diferentes poços da placa, medindo a absorbância a 380 nm, utilizando um leitor de placas de vários poços (os valores de absorbância são proporcionais às alturas do gel).
- Adicione 50 μL (7 μL para o formato de placa de 384 poços) das soluções mistas de DNA do concorrente (recozidas na etapa 3) sobre os géis. Tente adicionar todas as soluções concorrentes o mais simultaneamente possível usando pipetas eletrônicas multicanal ou um cabeçote de pipetagem de 96 canais, se disponível. Após a adição das soluções concorrentes, coloque a placa no microscópio stage e inicie as medições imediatamente.
6. Aquisição de imagem
- Adquira sequencialmente séries temporais de pilhas z (por exemplo, use 12 planos e 100-300 ms de tempo de iluminação). Evite tirar imagens muito próximas da superfície do poço (< ~ 1,4 μm com as placas aqui usadas) para excluir qualquer polarização
- Realize 10-25 ciclos de medições até a desligação completa do DNA de referência marcado do TF. O ponto final é normalmente alcançado após 1-2 h, dependendo da cinética de ligação e difusividade do DNA concorrente.
