1. Preparação do sistema
- Projeto de plasmídeos de sítio de ligação
- Projete o do local de encadernação conforme ilustrado na Figura 1. Cada minigene contém as seguintes partes (5' a 3'): sítio de restrição de Eagl, ∼40 bases da extremidade 5' do gene de resistência à canamicina (Kan), promotor pLac-Ara, sítio de ligação do ribossomo (RBS), AUG do gene mCherry, um espaçador (δ), um sítio de ligação RBP, 80 bases da extremidade 5' do gene mCherry, e um site de restrição ApaLI.
nota: Para aumentar a taxa de sucesso do ensaio, projete três de local de ligação para cada local de ligação, com espaçadores consistindo de pelo menos uma, duas e três bases. Consulte a seção Resultados representativos para obter mais diretrizes.
- Clonagem de plasmídeos de sítios de ligação
- Encomende os do local de ligação como minigenes de DNA de fita dupla (dsDNA). Cada minigene tem ∼500 pb de comprimento e contém um local de restrição Eagl e um local de restrição ApaLI nas extremidades 5 'e 3', respectivamente (consulte a etapa 1.1.1).
nota: Neste experimento, mini-genes com metade do gene da canamicina foram encomendados para facilitar a triagem de colônias positivas. No entanto, a montagem de Gibson também é adequada aqui, caso em que o local de ligação pode ser encomendado como dois oligos de DNA de fita simples complementares mais curtos.
- Digerir duas vezes os mini-genes e o vetor alvo com Eagl-HF e ApaLI pelo protocolo de restrição e purificar em coluna.
- Ligue os minigenes digeridos para a espinha dorsal do local de ligação contendo o restante do gene repórter mCherry, terminador e um gene de resistência à canamicina.
- Transforme a solução de ligação em células Escherichia coli TOP10
.
- Identifique transformantes positivos por meio do sequenciamento de Sanger.
- Projete um primer 100 bases a montante da região de interesse (consulte a Tabela 1 para sequências de primers).
- Miniprepare algumas colônias bacterianas.
- Preparar 5 μL de uma solução de 5 mM do primer e 10 μl de ADN a uma concentração de 80 ng/μL.
- Envie as duas soluções para uma instalação conveniente para sequenciamento Sanger.
- Armazene plasmídeos purificados a -20 °C e cepas bacterianas como estoques de glicerol, ambos no formato de 96 poços. O DNA será então usado para transformação em células E. coli TOP10 contendo um dos quatro plasmídeos RBP de fusão (consulte a etapa 1.3.5).
- Projeto e construção do plasmídeo RBP
NOTA: As sequências de aminoácidos e nucleotídeos das proteínas capsiês usadas neste estudo estão listadas na Tabela 2.
- Ordene a sequência RBP necessária sem um códon de parada como um minigene de dsDNA ordenado personalizado sem um códon de parada com locais de restrição nas extremidades (Figura 1).
- Clonar o RBP testado sem um códon de parada imediatamente a jusante de um promotor induzível e a montante de uma proteína fluorescente sem um códon de partida (Figura 1), semelhante às etapas 1.2.2-1.2.4. Certifique-se de que o plasmídeo RBP contém um gene de resistência a antibióticos diferente do plasmídeo do local de ligação.
- Identifique transformantes positivos por meio do sequenciamento de Sanger, semelhante à etapa 1.2.5 (consulte a Tabela 1 para sequências de primers).
- Escolha um transformador positivo e torne-o quimicamente competente. Armazenar como plasmídeos purificados de glicerol a -20 °C e estoques de glicerol de cepas bacterianas a -80 °C em placas de 96 poços.
- Transformar os plasmídeos do sítio de ligação (da etapa 1.2.6) armazenados em placas de 96 poços em células bacterianas quimicamente competentes que já contenham um plasmídeo RBP-mCerúleo. Para economizar tempo, em vez de colocar as células em placas de Petri, coloque-as em placas usando um pipetador de 8 canais em placas de 8 pistas contendo ágar Luria-Bertani (LB) com antibióticos relevantes (Kan e Amp). As colônias devem aparecer em 16 h.
- Selecione uma única colônia para cada transformante duplo e cultive durante a noite em meio LB com os antibióticos relevantes (Kan e Amp) e armazene como estoques de glicerol a -80 ° C em placas de 96 poços.
2. Configuração do experimento
NOTA: O protocolo aqui apresentado foi realizado usando um sistema robótico de manuseio de líquidos em combinação com uma incubadora e um leitor de placas. Cada medição foi realizada para 24 concentrações de indutores, com duas duplicatas para cada combinação cepa + indutor. Usando este sistema robótico, foram coletados dados para 16 cepas por dia com 24 concentrações indutoras. No entanto, se tal dispositivo não estiver disponível, ou se menos experimentos forem necessários, eles podem ser feitos facilmente manualmente usando uma pipeta múltipla de 8 canais e adaptando o protocolo de acordo. Por exemplo, resultados preliminares para quatro cepas por dia com 12 concentrações indutoras e quatro pontos de tempo foram adquiridos dessa maneira.
- Prepare, com antecedência, 1 L de tampão bioensaio (BA) misturando 0,5 g de triptona, 0,3 mL de glicerol, 5,8 g de NaCl, 50 mL de 1 M MgSO4, 1 mL de tampão salino tamponada com fosfato 10x (PBS) pH 7,4 e 950 mL de água bidestilada (DDW). Autoclave ou filtro estéril do tampão BA.
- Cultive as cepas duplamente transformantes a 37 ° C e 250 rpm agitando em 1,5 mL LB com antibióticos apropriados (canamicina a uma concentração final de 25 μg / mL e ampicilina a uma concentração final de 100 μg / mL), em placas de 48 poços, durante um período de 18 h (durante a noite).
- De manhã, faça os seguintes preparativos.
- Placa indutora. Em uma placa limpa de 96 poços, prepare poços com meio semi-pobre (SPM) consistindo de 95% BA e 5% LB26 na incubadora a 37 °C. O número de poços corresponde ao número desejado de concentrações de indutores. Adicione C4-HSL aos poços na placa indutora que conterá a maior concentração de indutor (218 nM).
- Programe o robô para diluir em série o meio de cada um dos poços de maior concentração em 23 concentrações mais baixas, variando de 0 a 218 nM. O volume de cada diluição do indutor deve ser suficiente para todas as estirpes (incluindo duplicados).
- Enquanto as diluições indutoras estão sendo preparadas, aqueça 180 μL de SPM na incubadora a 37 °C, em placas de 96 poços.
- Diluir as estirpes durante a noite do passo 2.2 por um factor de 100 por diluições em série: em primeiro lugar, diluir por um factor de 10 misturando 100 μL de bactérias com 900 μL de SPM em placas de 48 poços e, em seguida, diluir novamente por um factor de 10 retirando 20 μL da solução diluída para 180 μL de SPM pré-aquecido, em placas de 96 poços adequadas para medições fluorescentes.
- Adicionar o indutor diluído da placa indutora às placas de 96 poços com as deformações diluídas de acordo com as concentrações finais.
- Agite as placas de 96 poços a 37 °C por 6 h, enquanto faz medições de densidade óptica a 595 nm (OD595), mCherry (560 nm/612 nm) e mCerulean (460 nm/510 nm) fluorescência por meio de um leitor de placas a cada 30 min. Para fins de normalização, meça o crescimento do SMP sem adição de células.
